非酒精性脂肪肝病病人肝細(xì)胞中趨化因子CCL4的表達(dá)水平研究

[摘要] 目的 探討趨化因子CCL4在非酒精脂肪性肝病（NAFLD）病人肝細(xì)胞中的表達(dá)水平，評(píng)價(jià)CCL4的表達(dá)水平是否與NAFLD的病情進(jìn)展是否相關(guān)。方法 方便收集該院2013年1月—2015年11月間肝臟手術(shù)后分離培養(yǎng)的原代肝細(xì)胞39例，包括正常肝原代細(xì)胞13例、非酒精性脂肪肝病人肝細(xì)胞14例以及肝纖維化病人肝細(xì)胞12例，分別提取其細(xì)胞中總RNA樣品并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后，通過(guò)Real-time PCR方法分析CCL4 mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果 CCL4的表達(dá)水平在非酒精性脂肪肝（Steatosis）病人肝細(xì)胞中的表達(dá)水平為對(duì)照組的3.64倍；而在肝纖維化（Fibrosis）病人肝細(xì)胞中的表達(dá)水平則是對(duì)照組的33.69倍，是非酒精性脂肪肝組的9.25倍，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 CCL4的表達(dá)水平與非酒精性脂肪性肝病的發(fā)生及進(jìn)展呈正相關(guān)，可考慮用作NAFLD診斷及治療的新靶點(diǎn)來(lái)進(jìn)行進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)研究。

[關(guān)鍵詞] 非酒精性脂肪肝病；CCL4；表達(dá)水平

[中圖分類(lèi)號(hào)] R575 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-0742（2016）12（b）-0046-03

The Expression Level of Chemokine CCL4 in the Primary Hepatocytes from NAFLD Patients

HAN Ying

Clinical Laboratory Department， The First Hospital Affiliated to Xiamen University， Xiamen， Fujian Provnce，361003 China

[Abstract] Objective To study the expression level of CCL4 mRNA in the primary hepatocytes from NAFLD patients， aiming to investigate the potential correlation between the expression level of CCL4 and the development of NAFLD. Methods We Convenient selection from January 2013 to November 2015 after liver surgery from 39 cases of primary cultured hepatocytes， including normal liver cells， 13 cases of patients with nonalcoholic fatty liver cells and liver cells in 14 cases of patients with liver fibrosis in 12 cases， the total RNA were extracted from the cells in the sample and for reverse transcription， expression analysis the level of CCL4 mRNA by Real-time PCR method. Results The expression level of CCL4 in steatosis group was 3.64 fold of that in normal group.Further， the expression level of CCL4 in fibrosis group were 33.69 fold and 9.25 fold of those in normal group and steatosis group， respectively. The differences between groups were all statistically significant（P<0.05）. Conclusion The expression level of CCL4 was positively correlated with the development of NAFLD， making CCL4 a potential target for NAFLD prognosis and therapy.

[Key words] NAFLD；CCL4；Expression level

非酒精性脂肪肝病 （Non-Alcoholic Fatty Liver Disease， NAFLD）與肥胖密切相關(guān)。近年來(lái)，NAFLD的發(fā)病率呈明顯的上升趨勢(shì)，目前已成為西方發(fā)達(dá)國(guó)家的第一大慢性肝病[1]。已經(jīng)成為我國(guó)最常見(jiàn)的慢性肝病之一，其在人群中的發(fā)病率約為20%[2]。NAFLD可由單純的甘油三酯蓄積所表現(xiàn)出來(lái)的單純性脂肪肝（Steatosis），進(jìn)一步發(fā)展成為脂肪性肝炎（Non-alcoholic Steotohepatitis， NASH），并可能最終發(fā)展為肝纖維化，肝硬化等疾病。在NAFLD病情進(jìn)展中，肝臟中的炎癥反應(yīng)起了重要的作用。Chemokine （C-C motif） ligand 4 （CCL4）是一種趨化因子，它具有募集自由殺傷細(xì)胞及單核細(xì)胞等免疫細(xì)胞的作用[3]。它在NAFLD病情進(jìn)展中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。該研究方便收集了該院2013年1月—2015年11月間進(jìn)行肝膽外科手術(shù)的NAFLD不同階段病人的肝原代細(xì)胞39例，分析其中CCL4的表達(dá)水平，以評(píng)價(jià)CCL4的表達(dá)水平是否與NAFLD病情進(jìn)展具有相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

分別收取了未患NAFLD（13例）、酒精性脂肪肝（14例）、以及肝纖維化（12例）的病人肝原代細(xì)胞樣本39例，包括男性患者16例，女性患者23例，平均年齡為（43.0±17.5）歲。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑

該研究提取細(xì)胞中的總RNA過(guò)程中所使用的是Trizol試劑。RNA的逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量Real-time PCR則分別采用RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time PCR）試劑盒進(jìn)行。

1.3 研究方法

該研究采用Trizol法提取原代肝細(xì)胞中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，使用Roche LC480實(shí)時(shí)定量熒光PCR儀進(jìn)行分析，獲取的信使RNA（mRNA）含量經(jīng)由看家基因Cyclophilin進(jìn)行校正后，分析mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

該研究采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用One-way ANOVA檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

分析結(jié)果顯示，在酒精性脂肪肝組（Steatosis）中，CCL4的mRNA的表達(dá)水平約為對(duì)照組（Normal）的3.64倍，P<0.05， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而在肝纖維化組（Fibrosis）中，CCL4的表達(dá)水平分別約為對(duì)照組的33.69倍，以及非酒精性脂肪肝組的9.25倍，P<0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖1。

3 討論

在肥胖人群中，由于外周脂肪組織中所釋放的炎癥因子通過(guò)門(mén)靜脈進(jìn)入肝臟，使肝臟中同樣出現(xiàn)顯著的慢性炎癥反應(yīng)。炎癥反應(yīng)是非酒精性脂肪肝病的發(fā)展過(guò)程中具有非常重要的作用，它能夠促使由于脂質(zhì)蓄積所引起的非酒精性脂肪肝發(fā)展為非酒精性脂肪性肝炎，繼而發(fā)展為肝纖維化（Fibrosis）及肝硬化（Cirrhosis）等疾病[4-5]。趨化因子在肝臟募集免疫細(xì)胞的過(guò)程中具有重要的作用。目前，已有研究表明，趨化因子在非酒精性脂肪肝病的發(fā)展過(guò)程中同樣扮演了重要的角色[6]。

目前，趨化因子CCL4與非酒精性脂肪肝病中所起的作用在國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)報(bào)道。在該研究中，分析了在不同階段非酒精性脂肪性肝病病人的原代肝細(xì)胞中CCL4的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，非酒精性脂肪肝病人（Steatosis）的肝細(xì)胞中CCL4的表達(dá)水平顯著高于正常對(duì)照組，為對(duì)照組的3.64倍，提示CCL4可能與非酒精性脂肪肝的發(fā)生相關(guān)；進(jìn)一步的分析顯示，隨著病情進(jìn)展至肝纖維化（Fibrosis）階段，病人肝細(xì)胞中CCL4的表達(dá)水平有了進(jìn)一步的提高，達(dá)到了對(duì)照組的33.69倍，以及非酒精性脂肪肝組的9.25倍。這些結(jié)果反映CCL4在肝細(xì)胞中的表達(dá)水平隨著非酒精性脂肪性肝病病情的進(jìn)展而逐步升高，其表達(dá)水平與病情的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)性，提示它可能參與了非酒精性脂肪性肝病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程。

盡管CCL4在非酒精性脂肪肝病中的作用尚未得到充分的研究，但CCL4在細(xì)胞中的受體CCR5則已被報(bào)道在非酒精性脂肪性肝病發(fā)展至肝纖維化的過(guò)程中具有一定的作用。CCR5的激活能夠促進(jìn)非酒精性脂肪肝病的進(jìn)展，可引起早期肝纖維化[7]；而拮抗CCR5的活性則能夠顯著抑制小鼠的肝纖維化[8]。由于CCR5介導(dǎo)了CCL4在細(xì)胞中的作用通路，結(jié)合結(jié)果，有理由相信，CCL4可能在非酒精性脂肪性肝病發(fā)展的過(guò)程中具有一定的作用，可考慮作為非酒精性脂肪性肝病的治療靶點(diǎn)，進(jìn)行更深入的開(kāi)發(fā)研究。

[參考文獻(xiàn)]

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（收稿日期：2016-09-15）