鴨梨幼果石細胞分化期Pb4CL基因表達分析

摘要：為揭示梨果實石細胞分化的機理，調控石細胞形成和含量，克隆了鴨梨（Pyrus bretschneideri Rehd. ‘Yali’）4-香豆酸∶輔酶A連接酶基因Pb4CL片段（GenBank登錄號：KF177692），該片段長467 bp，經同源性比對，該片段與沙梨、歐洲花楸和枇杷等物種4CL基因高度同源，編碼155個氨基酸殘基，存在4CL蛋白質高度保守區域，具有腺苷酸合成class I超級結構域。建立了梨Pb4CL基因的熒光實時定量表達檢測體系，在石細胞分化期Pb4CL基因相對表達量逐漸升高，后呈下降趨勢。

關鍵詞：鴨梨（Pyrus bretschneideri Rehd. ‘Yali’）；4-香豆酸∶輔酶A連接酶；基因克隆；表達分析

中圖分類號：S661.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）23-6267-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.23.066

Abstract： In order to reveal differentiation and histogenesis mechanism of stone cells in fruitlets， and regulate and control the stone cell contents， Yali pear（Pyrus bretschneideri Rehd. ‘Yali’） fruits Pb4CL fragment was cloned（GenBank number：KF177692）. Pb4CL gene fragment was 467 bp. The analysis of the sequence revealed that the Pb4CL gene was highly homologous with that of other species such as Pyrus communis， Sorbus aucuparia and Eriobotrya japonica in amino acids. The gene fragment encode postulated proteins of 155 amino acids in which the high conserved domain of 4CL protein was， like AFD_class_I superfamily. Expression system of real-time fluorescence quantitative RT-PCR for detecting Pb4CL gene was established. The relative expression of Pb4CL gene was rised during stone cell differentiation， and had a falling trend.

Key words：Yali pear（Pyrus bretschneideri Rehd. ‘Yali’）； 4CL； gene cloning； expression analysis

梨（Pyrus spp.）是世界性的重要落葉果樹，是中國果樹栽培的重要樹種之一。梨果質脆、汁多、酸甜適口，多具芳香味，深受人們的喜愛，其食用品質受多種綜合因素的影響，其中石細胞是影響梨果實品質的關鍵因素之一[1，2]。石細胞為厚壁細胞的一種類型，由薄壁細胞經次生壁的強烈增厚且高度木質化而來，次生壁堅硬呈同心層次[3]。木質素是石細胞次生壁的主要成分之一[4-6]，包括3種類型——對羥基苯基木質素（H）、愈創木基木質素（G）和紫丁香基木質素（S），分別為對-香豆醇（p-coumaryl alcohol）、松柏醇（Coniferyl alcohol）與芥子醇（Sinapyl alcohol）3種單體聚合，它們都是苯丙烷類衍生的類苯丙酸化合物[7，8]，來源于香豆酸羥基化和甲基化的衍生物。4-香豆酸∶輔酶A連接酶（4CL），又稱羥基肉桂酸∶CoA連接酶、4-香豆酰∶輔酶A合成酶，它是苯丙氨酸代謝途徑的關鍵酶之一，可催化香豆酸、咖啡酸和阿魏酸及芥子酸形成相應硫酯，這些中間產物可進入木質素合成特異途徑，進一步合成木質素單體[9]。近年來，越來越多的學者開始關注4CL蛋白質及其基因序列，目前已經克隆了棉花[10]、煙草[11]、高粱[12]、水稻[13]等多種植物的4CL基因。該基因以小的基因家族形式存在，多具有2～4個成員[14]，且不同成員催化底物特異性存在差異，其在苯丙烷代謝途徑中參與的分支途徑不同。有研究發現，當4CL活性受到抑制時，擬南芥植株木質素含量會降低50%[15]，且改變了木質素的類型，說明4CL基因在調控木質素合成中也扮演了重要角色。張夏南等[16]從黃金梨果肉中克隆了10個與木質素合成相關的cDNA，經熒光實時定量分析發現Pp4CL1和Pp4CL2在幼果期表達，而在果實發育后期基因相對表達量較低。本研究以石細胞分化期鴨梨幼果為試材，克隆了4CL基因片段，并建立了相應的熒光實時定量表達檢測體系，研究其在次生壁分化期的表達變化，分析其在此過程中的作用，為研究木質素與次生壁木質化的關系提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗地為河北農業大學標本園，位于河北省保定市郊區，為沖積平原潮土，黏壤，肥力中等，樹齡12年生，生長結果正常，花期平均溫度16.2 ℃，相對濕度30%～50%。供試材料為盛果期鴨梨（Pyrus bretschneideri Rehd. ‘Yali’）。4月初蕾期選擇生長勢一致的鴨梨樹10棵，于花蕾大氣球期在樹冠的中層南部選擇花蕾發育期基本一致的短果枝掛牌，每序只留第1、2朵邊花。開花當日采用雪花梨花粉對其進行授粉，采集花后8、10、12、14、16、18、20 d幼果，剔去子房中心部位，液氮速凍，-70 ℃冰箱保存備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA的提取及cDNA合成 總RNA的提取方法參考孫雯[17]的方法并進行優化。根據TransGen公司的TransScriptTM One-Step gDNA Removal 和cDNA Synthesis Super Mix的操作說明進行cDNA的合成，產物在-70 ℃下保存備用。

1.2.2 4CL蛋白質編碼基因保守區片段的克隆 根據GenBank中的沙梨（Pyrus pyrifolia）、花楸（Sorbus aucuparia）、枇杷（Eriobotrya japonica）等薔薇科植物4CL蛋白質編碼基因的保守區序列，利用Primer Primier 5.0設計上下游引物F1（5′-CGTCGCTCTAC CCTACTC-3′，5′-CTGCCTCTGTCATTCCAT-3′），由北京華大基因公司合成。反應體系為10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）1.6 μL，上游引物F1（20 μmol/L）0.4 μL，下游引物R1（20 μmol/L）0.4 μL，模板cDNA 2 ng，Taq酶（5 U）0.4 μL，MgCl2 2.0 μL，加ddH2O 至25 μL。反應程序為94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，33個循環；72 ℃ 10 min。將克隆獲得的產物切膠回收，與pMD19-T載體連接后轉化DH5α，37 ℃過夜培養，挑取陽性克隆，經菌體PCR驗證正確后送華大（北京）股份有限公司測序。

1.2.3 石細胞分化期Pb4CL表達分析 以蘇雅男[18]設計的梨β-actin基因擴增引物ACT-F（5’- TTGGGATGGGTCAGAAGG-3’）、ACT-R（5’-CTGTGAGCAGAACTGGGTG-3’）作為內參引物。根據已克隆得到的4CL基因片段序列利用Primer Premier 5.0和Oligo 6.0軟件設計實時定量PCR引物4CL-F（5’-GTGATGCTAACGCACAAGGG-3’）、4CL-R（5’-AGTGGCAGCACGCATAAGAC-3’）。并對引物進行特異性驗證，擴增產物以1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。采用TaKaRa公司的SYBR-Green Real-time PCR Master Mix試劑盒，反應在Mastercycler ep realplex4 real-time PCR儀（Eppendorf，德國）上進行。反應體系為cDNA模板（50 mg/μL）1 μL、上下游引物（20 μmol/L）各0.25 μL、SYBR？誖Premix ExTaqTM Ⅱ 10 μL，加ddH2O至20 μL，每個樣品3個重復。反應程序為94 ℃ 1 min；94 ℃ 15 s，57.5 ℃ 15 s，72 ℃ 45 s，共40個循環。利用2-ΔΔCT法計算基因的相對表達量。

1.2.4 生物信息學分析 序列經Vecscreen（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/vecscreen/）去載體后，利用NCBI）的BLAST分析程序進行比對；利用DNAMAN生物學軟件對基因的氨基酸序列進行分析；并利用DNAMAN、BLAST軟件搜索GenBank/NCBI/RGP中的同源序列以及編碼氨基酸序列，進行同源性分析。蛋白質的保守結構域預測由NCBI的Conserved Domain Search tool（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）完成。

1.2.5 4CL酶活性測定 參照饒國棟等[19]的方法并略作調整。

2 結果與分析

2.1 4CL蛋白編碼基因cDNA片段克隆

以鴨梨石細胞分化期幼果提取的總RNA反轉錄得到的cDNA為模板，采用特異性引物F1和R1進行RT-PCR擴增，電泳結果顯示得到一條500 bp左右清晰的條帶（圖1），與預期目的片段大小一致，將該片段命名為Pb4CL。將所得產物切膠回收，純化后，采用pMD19-T載體連接，轉化至大腸桿菌感受態細胞DH5α，菌液PCR檢測鑒定陽性克隆，菌液PCR結果顯示克隆片段已成功轉入大腸桿菌。陽性克隆送北京六合華大基因公司測序。測序結果經Vecscreen（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/vecscreen/）去除載體序列。測序結果與預期結果大小相近，該片段長度為467 bp的4CL基因cDNA核苷酸序列。經DNAMAN軟件分析，其最大讀碼框位于2～466 bp之間，編碼155個氨基酸殘基（圖2）。

2.2 Pb4CL基因片段編碼蛋白質分析

將所測鴨梨PbLAC基因序列與NCBI中收錄的梨及相關近緣物種進行同源性比較，利用Blast程序在GenBank中的核酸數據進行比對分析（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/）。鴨梨Pb4CL基因cDNA片段序列與沙梨（Pyrus pyrifolia，JX290374.1）、歐洲花楸（Sorbus aucuparia，GU938595.1）、枇杷（Eriobotrya japonica，EF685345.1）和樹莓（Rubus idaeus，AF239687.1）等物種的同源性分別為99%、99%、96%和81%，因此證明該序列即為4CL基因序列，定名為Pb4CL，GenBank登錄號為KF177692。利用在線工具ProtParam tool（http：//web.expasy.org/protparam/）對Pb4CL基因編碼氨基酸序列進行分析。在所得氨基酸序列中，除Trp、Pyl和Sec外其他氨基酸均有涉及，其中Leu的含量最高，占氨基酸總數的14.8%；Val次之，占氨基酸總數的10.3%。利用DNAMAN軟件對所得氨基酸序列、沙梨（GI470133579）、歐洲草莓（GI460408299）、花楸（GI508715386）等已知4CL蛋白質序列進行同源比對，同源性分別為100%、99.35%、92.6%（圖3）。通過NCBI的Conserved Domain Search Tool 對其結構域進行分析，在鴨梨PbLAC基因編碼的蛋白質屬腺苷酸合成class I超家族，包含4CL蛋白絕對保守區域“SSTGTTG”，在該序列中具有多個CoA和AMP結合位點（圖4），因此證實該基因編碼的氨基酸序確實為4CL蛋白質序列，該核苷酸序列可以用于進行下一步的熒光定量分析。

利用MEGA 5.05軟件對氨基酸序列進行比對，并建立了系統進化樹。鴨梨Pb4CL基因編碼蛋白質與另外10種植物的進化關系如圖5所示。薔薇科蘋果亞科沙梨、鴨梨、花楸、枇杷分到一組，其中鴨梨和沙梨關系最近，而薔薇亞科智利草莓、歐洲草莓和樹莓分到一組，毛白楊和歐洲大葉楊分到一組。從所得氨基酸與其他植物4CL蛋白質序列分析的遺傳距離得出，在植物形態學上近緣的植物類型其4CL蛋白質表現進化關系較近，說明4CL蛋白質在進化過程中存在高度保守性，也進一步驗證了所得序列的可靠性。

2.3 石細胞分化期Pb4CL基因表達分析

利用實時熒光定量PCR（Real-time PCR）技術，以鴨梨β-Actin為內參，分析了4CL在石細胞分化期的表達情況。在石細胞分化期，4CL表達量變化如圖6所示，在開花后第10天，Pb4CL表達量略有下降，此后逐漸升高，在第14天略有下降但差異不明顯，在開花后第18天出現峰值，開花后20 d開始下降。Pb4CL基因表達變化與酶活性測定相近，且在石細胞次生壁大量分化期出現明顯變化，Pb4CL與石細胞分化存在一定關聯。

2.4 石細胞分化期相關酶活性變化

為進一步驗證石細胞分化期Pb4CL基因的表達變化，對4CL酶進行測定分析。如圖7所示，在石細胞分化期4CL酶活性呈先下降后升高的趨勢，鴨梨在開花第16天出現峰值，達146.0 U/g（FW），在花后20 d明顯下降。對4CL活性及Pb4CL基因表達量進行相關性分析，結果表明二者呈顯著正相關（R=0.801）。

3 討論

4CL位于苯丙氨酸代謝途徑的分支點上，參與類黃酮物質和木質素的合成代謝[20]，可催化香豆酸、阿魏酸、咖啡酸、芥子酸等與CoA形成相應的輔酶A酯，而后者則可進入苯丙烷類分支途徑通過還原反應生成木質素單體，因此4CL是木質素合成的限速酶之一[21]。目前，已在水稻[13]、棉花[10]、高粱[12]、沙梨[16]等物種上分離到4CL基因。本研究中克隆了鴨梨Pb4CL基因片段，通過與GenBank中收錄的4CL基因序列進行同源性比對，該片段與沙梨、枇杷等薔薇科植物4CL基因同源性極高。通過Pb4CL編碼氨基酸序列分析，發現其具有“SSTGTTGLPKGV”結構域[14]，而該結構域同是所有植物4CL蛋白質的絕對保守區域，此外在該氨基酸序列中，具有多個CoA和AMP結合位點。從氨基酸序列的進化關系來看，鴨梨Pb4CL編碼蛋白質與沙梨等薔薇科物種蛋白質遺傳距離最短，說明4CL蛋白質在進化中具有保守性，也進一步證實該片段編碼序列為鴨梨4CL蛋白質序列。

研究證實，在美洲山楊中Pt4CL1參與木質素形成，Pt4CL2參與類黃酮生物合成[21]，Lee等[22]通過反義基因技術抑制擬南芥中的4CL酶活性，擬南芥木質素組分紫丁香基木質素顯著增加，總木質素含量顯著下降。Sun等[20]研究發現在水稻中，4CL主要以4-香豆酸和阿魏酸為底物參與木質素的單體合成。在多項研究中均證實4CL蛋白質參與木質素的合成[14，23]，王斌等[24]認為套袋可降低PAL、C4H、4CL和CAD的活性，使中間產物含量降低，從而抑制石細胞的產生。鴨梨Pb4CL基因的表達變化與鴨梨幼果石細胞分化期4CL酶活性變化相近，說明本研究建立的熒光實時定量表達檢測體系能夠反應4CL蛋白質的活性變化。由于鴨梨石細胞出現于花后2周，并在此后大量出現，本研究中克隆的鴨梨Pb4CL基因表達量在石細胞分化期出現上調表達，與石細胞次生壁出現的時期一致，此時木質素大量積累，說明在梨石細胞分化期4CL參與了石細胞次生壁的形成。在開花后20 d大量石細胞次生壁已經初步形成，僅在石細胞團外部有部分細胞繼續分化，這可能與后期Pb4CL基因表達量出現下降有關，其結果有待于進一步研究。

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