豬MBF1基因的多態性及與生產性狀的關聯分析

摘要：分離克隆了豬MBF1基因第4外顯子的序列，測序發現在18 bp處存在T/C突變，引起TaqI酶切多態。利用PCR-RFLP方法對國內外4個豬種MBF1基因第4外顯子的多態性進行分析發現，在國外豬種中等位基因T的的頻率占優勢；在中國豬種中C等位基因的頻率占優勢；在437頭大梅F2代資源家系中進行性狀關聯分析發現該多態與瘦肉率、板油重、肩部背膘厚、眼肌高、眼肌寬、眼肌面積顯著相關（P<0.05）。

關鍵詞：豬MBF1基因；PCR-PFLP；多態性；性狀關聯分析

中圖分類號：S828.8+9 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）23-6192-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.23.048

Abstract： Cloning and Sequencing of the 4th exon of porcine MBF1 gene indicated that a T18C substitution which can be detected by restriction endonuclease TaqI. This polymorphism was analyzed with PCR-RFLP among four foreign and Chinese pig breeds. Analysis result showed that allele T was predominant in foreign pig breeds；however allele C was predominant in Chinese pig breeds. Statistical analysis in 437 Large White×Meishan F2 progeny pigs showed that the TaqI polymorphism was associated with lean meat percentage，leaf fat weigh，shoulder fat thickness，loin eye height，loin eye width，loin eye area，significantly（P<0.05）.

Key words： porcine MBF1 gene； PCR-RFLP； polymorphism； association analysis

多蛋白橋梁因子（Multiprotein bridging factor 1， MBF1）是一種核受體輔激活因子，它通過橋連通用轉錄因子TBP增強特異性轉錄因子的DNA結合活性，增強結合的靶基因的啟動子活性，介導靶基因的轉錄激活，調節生物體的各種生命活動[1-3]。MBF1是一個高度保守的調節內皮細胞分化、中樞神經系統發育、脂類和組氨酸新陳代謝的轉錄輔激活蛋白[4，5]，同時可以調節類固醇激素的生成[6]。MBF1還可以增強一些與脂類代謝相關的核受體轉錄激活，調節脂質的動態代謝平衡[4]。

1 材料與方法

1.1 動物和組織樣品

基因克隆及SNP篩選的樣品：大白豬（湖北省農科院畜牧獸醫研究所原種豬場）、梅山豬（英山縣綠源養豬專業合作社）二月齡肌肉組織提取RNA。

用于基因頻率分析的樣品：大白豬（湖北省農科院畜牧獸醫研究所原種豬場）、長白豬（華中農業大學試驗豬場）、梅山豬（英山縣綠源養豬專業合作社）、通城豬（通城縣種豬場）共143頭，前腔靜脈采血，提取DNA。

用于性狀關聯分析的樣品：大白豬和梅山豬雜交產生的F2代群體（華中農業大學試驗豬場）437頭，分別提取個體DNA并做好性狀記錄。

DNA的提取：采用傳統的苯酚/氯仿提取法。

RNA的提?。喊凑誌nvitrogen公司的TRIzol試劑盒說明書進行提取。

1.2 引物及主要試劑

根據大白豬MBF1基因序列，設計豬的第4外顯子的特異引物Primer pair，引物序列如下：

Forward primer：GAACAAACAGCACTCAATCAC

Reverse primer：TTCAGGAGCATGTGCCTA

引物由上海生工生物技術有限公司合成，去離子水溶解，-20 ℃保存。pMD-18T vector system、DH5α購自TaKaRa公司（大連）；Gel Extraction Kit購自上海生工生物技術有限公司。

1.3 PCR擴增與克隆、測序

PCR擴增體積為25 μL，體系中各組分的濃度為50 ng模板DNA、1×PCRmix、0.5 mmol/L PCR primers，PCR的運行程序如下：預變性94 ℃ 4 min； 94 ℃ 45 s，61 ℃ 45 s，72 ℃50 s，35個循環；最后72 ℃延伸10 min。

PCR產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測；將目的帶用Gel Extraction Kit試劑盒純化回收，回收后的PCR產物片段與pMD-18T vector system連接并轉化DH5α，克隆子送北京奧科生物技術有限公司測序。

1.4 PCR-RFLP分析

選用TaqI對PCR 產物進行消化，酶切反應總體系為10 μL，其中PCR 擴增產物5 μL，限制性內切酶0.5 μL（10 U/μL），10×Buffer 1 μL，ddH2O 3.5 μL，65 ℃恒溫反應4 h，后經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.5 統計分析

用Qiao等[7]介紹的單標記回歸統計模型，使用SAS統計軟件（SAS Institute Inc，Version 8.0）的GLM程序進行單標記方差分析，同時用REG程序計算基因的顯性效應和加性效應，并進行顯著性檢驗。加性效應用-1，0和1分別代表TT、TC和CC基因型，顯性效應用1，-1和1分別代表TT、TC和CC基因型。所采用模型為：Yijk=μ+Si+Yj+Gk+bijkXijk+eijk，其中Yijk為性狀表型值，μ為群體均值，Si為性別效應，Yj 是年份效應，Gk為基因型效應，bijk為屠宰體重的回歸系數，Xijk是協變量屠宰體重，eijk為殘差效應。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增產物

Primer pair分別在大白豬、梅山中擴增，取擴增產物5 μL在1%的瓊脂糖上電泳，其大小為760 bp，與GenBank上公布的豬MBF1基因的序列大小相一致（圖1）。PCR產物測序，結果發現在第4外顯子18 bp處有1個T-C突變（圖2），引起TaqI酶切（T，CGA）多態。

2.2 擴增產物的PCR-RFLP分析

該位點經限制性內切酶TaqI酶切分析發現：當第4外顯子18 bp處的堿基為C時TaqI酶切該位點，記為CC型（354 bp+325 bp+81 bp），當該位點堿基都為T時TaqI不識別該位點，記為TT型（679 bp+81 bp），當C和T都存在時記為CT型（679 bp+354 bp+325 bp+81 bp）。豬MBF1基因的PCR- TaqI-RFLP的酶切分型結果如圖3。

2.3 豬MBF1基因TaqI位點在不同豬種中的基因頻率和基因型頻率

在中外4個品種豬中檢測MBF1基因第4外顯子PCR-TaqI-RFLP多態性基因頻率分布，檢測結果如表1所示。在國外豬種中等位基因T的的頻率占優勢，大白、長白豬T等位基因的頻率分別為0.81和0.86；而在中國豬種中C等位基因的頻率占優勢，在梅山和通城豬中C等位基因的頻率分別為0.94和0.71。

2.4 豬MBF1基因TaqI位點基因型與生產性狀的關聯分析

應用SAS軟件運行GLM和REG程序，進行豬MBF1基因PCR-TaqI-RFLP不同基因型與豬生產性狀的關聯分析和遺傳效應估計，基因型檢測結果表明：在所檢測的437頭大白×梅山F2代個體中，TT基因型134頭，CT基因型204頭，CC基因型99頭。不同基因型與生產性狀間的統計結果見表2。

統計結果顯示，MBF1基因第4外顯子PCR-TaqI-RFLP多態性與瘦肉率、板油重、肩部背膘厚、眼肌高、眼肌寬、眼肌面積顯著相關（P<0.05）；眼肌高、眼肌面積加性效應顯著（P<0.05），瘦肉率、肩部背膘厚加性效應極顯著（P<0.01）。板油重、眼肌寬顯性效應顯著（P<0.05）。TT基因型有較高的瘦肉率、眼肌高、眼肌寬和眼肌面積。

3 討論

本研究中，TT基因型有較高的瘦肉率、眼肌高、眼肌寬和眼肌面積；瘦肉豬品種大白豬、長白豬群體中T基因頻率占優勢，在中國本地品種梅山豬、通城豬中C等位基因占優勢，說明T基因可能具有提高瘦肉率，降低背膘厚的效應；而C基因可能具有促進脂肪沉積降低瘦肉率的效應。

瘦肉率、肩部背膘厚、眼肌面積、眼肌高加性效應顯著，加性效應是可以遺傳的，因此可以采用分子標記輔助選擇和常規選擇項結合的方法對豬屠宰率、背膘厚、眼肌面積等性狀進行固定。顯性效應主要基因互作的結果，顯性效應性狀可通過雜交獲得較好選擇效果[8]。

MBF1是調節脂類和組氨酸等代謝的轉錄激活蛋白，可以調節類固醇激素的生成，調控脂肪代謝動態平衡[4-6]，為MBF1基因作為調節脂肪沉積性狀的候選基因提供了生理功能依據。本研究證實了MBF1基因第4外顯子T/C突變與瘦肉率、背膘厚等脂肪沉積相關性狀存在顯著的相關性，為該因作為調節脂肪沉積性狀的候選基因提供了統計學依據，綜上所述，MBF1基因可以作為豬脂肪沉積性狀的候選基因。

參考文獻：

[1] TAKEMARU K，LI F Q，UEDA H，et al.Multiprotein bridging factor 1（MBF1） is an evolutionarily conserved transcriptional coactivator that connects regulatory factor and TATA element-binding protein[J].Proc Natl Acad Sci，1997，94：7251-7256.

[2] TAKEMARU K，HARASHIMA S，UEDA H，et al.Yeast coactivator MBF1 mediates GCN4-dependent transcriptional activation [J].Mol Cell Bio，1998，18：4971-4976.

[3] OZAKI J，TAKEMARU K，IKEGAMI T，et al.Identification of the core domain and the secondary structure of the transcriptional coactivator MBF1[J].Genes Cells，1999，4：415-424.

[4] BRENDEL C，GELMAN L，AUWERX J. Multiprotein bridging factor 1（MBF1） is coactivator for nuclear receptors that regulate lipid metabolism[J].Mol Endocrinol，2002，16：1367-1377.

[5] LIU Q X，JINDRA M，UEDA H，et al.Drosophila MBF1 is coactivator for tracheae defective and contributes to the formation of tracheal and nervous system[J].Development，2003，130： 729-728.

[6] KABE Y，GOTO M，SHIMA D，et al. The role of human MBF1 as a transcriptional coactivator[J].J Bio Chem，1999，274：34196-34202.

[7] QIAO M，WU H Y，LI F，et al.Molecular characterization，expression profile and association analysis with carcass traits of porcine LCAT gene[J].Molecular Biology Reports，2010，37（5）：2227-2234.

[8] 武華玉，喬 木，黃京書.豬USF1基因的多態性及與生產性狀的關聯分析[J].湖北農業科學，2014，53（24）：6064-6067.