超聲波處理對(duì)羽扇豆種子活力及生理特性的影響

摘要：采用超聲波處理羽扇豆（Lupinus micranthus Guss.）種子，對(duì)羽扇豆種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、活力指數(shù)、種子浸出液的相對(duì)電導(dǎo)率和幼苗的超氧化物歧化酶（SOD）活性、可溶性蛋白含量、丙二醛（MDA）含量等進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)超聲波處理的羽扇豆種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率都得到了提高，以20 min的處理時(shí)間為最佳；處理后提高了羽扇豆幼苗的SOD活性和可溶性蛋白含量，降低了幼苗MDA含量和種子浸出液的相對(duì)電導(dǎo)率，提高了種子活力。說(shuō)明羽扇豆種子萌發(fā)之前采用適宜的短時(shí)間超聲波處理，不僅能促進(jìn)萌發(fā)，還能促進(jìn)其抗氧化能力的提高。

關(guān)鍵詞：羽扇豆（Lupinus micranthus Guss.）；超聲波；種子活力；生理特性

中圖分類(lèi)號(hào)：S681.9∶S122 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）20-5282-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.20.029

Abstract：After using ultrasonic treatment on lupin （Lupinus micranthus Guss.） seed， the indices including germination potential， germination rate， vigor index， superoxide dismutase（SOD） activity， soluble protein content， and malondialdehyde（MDA） content were checked. The results showed that the germination potential， germination rate and seed vigor of lupin seeds have been improved after ultrasonic treatment. The best treatment time is 20 min. Ultrasonic treatment can enhance lupin seeds vigor， SOD activity and increase soluble protein content while reduce MDA content and seed leachate conductivity， therefore enhance the vitality of seeds. Using ultrasonic treatment on lupin seeds for a suitable short time before germination could not only promote germination but also improve their antioxidant capacity.

Key words： lupin（Lupinus micranthus Guss.）； ultrasonic wave； seed vigor； physiological characteristics

超聲波是指頻率高于20 kHz的一種彈性機(jī)械波，其生物學(xué)效應(yīng)非常復(fù)雜，既可引起生物分子或細(xì)胞損傷，也可促進(jìn)生物大分子的合成與生物體的生長(zhǎng)。由于超聲波處理無(wú)化學(xué)殘留、安全性高、簡(jiǎn)便有效，近年來(lái)在生物學(xué)、農(nóng)業(yè)技術(shù)方面得到了廣泛應(yīng)用。植物種子經(jīng)超聲波處理后，可以提高種子活力、促進(jìn)種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)、增加植物的抗逆能力及產(chǎn)量[1-4]。羽扇豆（Lupinus micranthus Guss.），為豆科（Leguminosae）羽扇豆屬（Lupinus L.）多年生草本植物，多以播種繁殖，春秋播均可。羽扇豆豐富的花色及特別的植株形態(tài)是園林植物造景中較為難得的配置材料，觀賞價(jià)值很高，用作花境背景或在林緣河邊叢植、片植等，會(huì)使人們的視覺(jué)產(chǎn)生別樣的感受，因而被專(zhuān)業(yè)人士接納與推崇。此外，羽扇豆還具有飼用價(jià)值，莖葉可用于青飼和放牧，也可制作青貯，是豬和奶牛良好的飼料[5]，因此在農(nóng)、林、牧業(yè)里具有巨大的開(kāi)發(fā)價(jià)值，也由此產(chǎn)生了強(qiáng)勁的市場(chǎng)需求。試驗(yàn)采用超聲波處理羽扇豆種子，研究其對(duì)種子萌發(fā)及活力的影響，旨在為羽扇豆的標(biāo)準(zhǔn)育苗及規(guī)?；a(chǎn)提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

羽扇豆種子在韶關(guān)市當(dāng)?shù)鼗ɑ苁袌?chǎng)購(gòu)買(mǎi)，試驗(yàn)時(shí)間在2014年9～11月，試驗(yàn)地點(diǎn)在韶關(guān)學(xué)院英東農(nóng)業(yè)科學(xué)與工程學(xué)院植物學(xué)實(shí)驗(yàn)室。儀器主要有KQ218超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、DDS-11A型電導(dǎo)率儀（上海光學(xué)儀器廠）；南京建成生物工程研究所提供試驗(yàn)用測(cè)試盒。

1.2 方法

1.2.1 超聲波處理 將子粒飽滿(mǎn)的羽扇豆種子進(jìn)行漂洗，洗干凈后裝入紗布袋中，放入超聲波清洗器內(nèi)對(duì)種子進(jìn)行超聲波處理，溫度波動(dòng)控制在5 ℃之內(nèi)。試驗(yàn)共設(shè)5個(gè)處理，處理時(shí)間分別為5、10、15、20、25 min，以不經(jīng)任何處理的羽扇豆種子作為對(duì)照（CK），處理結(jié)束后浸種12 h，將各處理其中一部分種子用于發(fā)芽試驗(yàn)，進(jìn)行生長(zhǎng)指標(biāo)的測(cè)定；另一部分用于生理指標(biāo)的測(cè)定。

1.2.2 生長(zhǎng)指標(biāo)的測(cè)定 將超聲波處理后的種子放入種子發(fā)芽盒中，再放入培養(yǎng)箱中發(fā)芽，培養(yǎng)箱溫度為25 ℃，每處理50粒種子，重復(fù)3次。每天觀察并記載種子發(fā)芽情況，第七天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率，并對(duì)幼苗重量稱(chēng)重，計(jì)算發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)。

發(fā)芽率：P=G/S，

式中，G指在測(cè)定時(shí)間內(nèi)正常發(fā)芽的種子數(shù)，S為參試種子數(shù)。

發(fā)芽指數(shù)=ΣGt/Dt，

式中，Gt指在不同時(shí)間（第t天）內(nèi)的發(fā)芽量，Dt指不同的發(fā)芽試驗(yàn)天數(shù)。

活力指數(shù)：活力指數(shù)=發(fā)芽指數(shù)×幼苗鮮重。

1.2.3 生理指標(biāo)測(cè)定 ①相對(duì)電導(dǎo)率測(cè)定，參照文獻(xiàn)[6]的方法，用DDS-11A型電導(dǎo)率儀測(cè)定羽扇豆種子浸出液的相對(duì)電導(dǎo)率。每處理50粒種子，重復(fù)3次。②超氧化物歧化酶（SOD）活性、可溶性蛋白及丙二醛（MDA）含量測(cè)定，從處理后生長(zhǎng)15 d的幼苗中，隨機(jī)選取30株完整幼苗，分成葉片和幼莖2個(gè)部分，分別進(jìn)行SOD活性、可溶性蛋白及MDA含量測(cè)定。每處理都設(shè)3次重復(fù)，準(zhǔn)確稱(chēng)取0.5 g幼苗的葉片和幼莖，剪碎，加入預(yù)冷的勻漿介質(zhì)3 mL，于冰浴中的研缽內(nèi)研磨成勻漿，再分別用3 mL的研磨介質(zhì)沖洗2次，轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中，于2 000 r/min下冷凍離心15 min，上清液即為蛋白含量和酶活性測(cè)定的粗提液。利用南京建成生物工程研究所提供的測(cè)試盒，分別對(duì)羽扇豆幼苗的可溶性蛋白含量、SOD活性、MDA含量進(jìn)行測(cè)定?？扇苄缘鞍缀坑每捡R斯亮藍(lán)法測(cè)定[7]，SOD活性采用黃嘌呤氧化酶法（羥氨法）測(cè)定[8]，MDA含量采用硫代巴比妥酸法測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用Microsoft Office Excel 2003軟件處理，并用其制表、做圖；在SPSS 16.0軟件環(huán)境下，運(yùn)用鄧肯氏新復(fù)極差檢驗(yàn)法（Duncan's new multiple range test，DMRT）進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同超聲波處理時(shí)間對(duì)羽扇豆種子萌發(fā)特性的影響

超聲波處理時(shí)間對(duì)羽扇豆種子萌發(fā)特性的影響情況見(jiàn)表1。從表1可見(jiàn)，超聲波處理時(shí)間可不同程度地影響羽扇豆種子的發(fā)芽能力，萌發(fā)特性各指標(biāo)發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、幼苗重均高于對(duì)照。在種子發(fā)芽勢(shì)方面，超聲處理5、10、15、20、25 min后，分別比對(duì)照提高了26.68%、10.00%、3.33%、13.33%、10.00%，以超聲處理5 min的效果最好，但各處理與對(duì)照間差異不顯著（P>0.05）；在種子發(fā)芽率方面，超聲處理5、10、15、20、25 min后，分別比對(duì)照提高了27.02%、18.93%、43.26%、32.43%、35.11%，以15 min的超聲處理效果最好，并且各處理與對(duì)照間差異顯著（P<0.05）；在幼苗重方面，超聲處理5、10、15、20、25 min后，分別比對(duì)照提高了15.97%、10.67%、26.89%、31.42%、24.69%，其中處理20 min的效果最好，除了處理10 min的與對(duì)照間差異不顯著（P>0.05）外，其他處理與對(duì)照間差異顯著（P<0.05）；在發(fā)芽指數(shù)方面，超聲處理5、10、15、20、25 min后，分別比對(duì)照提高了27.27%、14.55%、21.82%、21.82%、31.82%，其中以處理25 min的發(fā)芽指數(shù)最大，除了處理10 min的與對(duì)照間差異不顯著（P>0.05）外，其他處理與對(duì)照間差異顯著（P<0.05）；在活力指數(shù)方面，超聲處理5、10、15、20、25 min后，分別比對(duì)照提高了47.65%、26.47%、54.70%、60.00%、64.12%，但各處理與對(duì)照間差異不顯著（P>0.05）。綜合分析來(lái)看，以超聲波處理20、25 min的效果最佳，其中處理20 min后胚根較粗壯，其發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率分別達(dá)到45.33%和65.33%，分別比對(duì)照提高13.33%和32.43%，發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)分別比對(duì)照高21.82%和60.00%，活力指數(shù)是反映種子活力的綜合指標(biāo)，粗壯發(fā)達(dá)的根系有利于幼苗的生長(zhǎng)和抵御外界不良環(huán)境的影響。

2.2 不同超聲波處理時(shí)間對(duì)羽扇豆種子浸出液相對(duì)電導(dǎo)率的影響

電導(dǎo)率的大小在一定程度上反映了植物種子細(xì)胞膜的完整程度和修復(fù)能力，不同超聲波處理時(shí)間對(duì)羽扇豆種子浸出液相對(duì)電導(dǎo)率的影響情況見(jiàn)圖1。由圖1可以看出，通過(guò)超聲波處理羽扇豆種子5～25 min后，可降低種子浸出液的相對(duì)電導(dǎo)率，從而使種子細(xì)胞膜的透性下降，達(dá)到減少?gòu)募?xì)胞內(nèi)流出內(nèi)含物的目的，進(jìn)而為促進(jìn)種子萌發(fā)和提高種子活力提供幫助。種子浸出液的相對(duì)電導(dǎo)率大小反映了膜透性的高低，相對(duì)電導(dǎo)率高，膜透性大，溶質(zhì)外滲增多。由圖1可見(jiàn)，經(jīng)超聲波處理后，種子浸出液的相對(duì)電導(dǎo)率在處理5、10、15、20、25 min后，分別比對(duì)照降低了30.0%、16.7%、30.0%、25.0%、30.8%，說(shuō)明適宜的超聲波處理時(shí)間具有穩(wěn)定細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)、增加細(xì)胞修復(fù)能力的作用。

2.3 超聲波處理對(duì)羽扇豆生理特性的影響

2.3.1 超聲波處理對(duì)羽扇豆幼苗SOD活性的影響 SOD廣泛存在于植物細(xì)胞中，與細(xì)胞的抗氧化能力相關(guān)；不同超聲波處理時(shí)間對(duì)羽扇豆幼苗SOD活性的影響情況見(jiàn)表2。由表2可以看出，不同超聲波時(shí)間處理后，幼莖的SOD活性均受到激發(fā)效應(yīng)而升高，在處理5、10、15、20、25 min后，羽扇豆幼苗幼莖的SOD活性分別比對(duì)照提高了60.39%、36.11%、7.06%、38.33%、15.72%，其中處理5、10、20 min的SOD活性顯著高于對(duì)照（P<0.05）；葉片的SOD活性分別比對(duì)照提高了36.79%、42.77%、23.90%、20.75%、31.13%，其中處理5、10、25 min的SOD活性與對(duì)照差異顯著（P<0.05）。

2.3.2 超聲波處理對(duì)羽扇豆幼苗MDA含量的影響 細(xì)胞里MDA含量的多少，能在一定程度上反映膜脂過(guò)氧化作用的強(qiáng)弱和細(xì)胞膜系統(tǒng)的完整程度，不同超聲波處理時(shí)間對(duì)羽扇豆幼苗MDA含量的影響情況見(jiàn)表2。從表2可見(jiàn)，不同超聲波時(shí)間處理后，羽扇豆幼莖的MDA含量變化有所不同，除了處理 5 min的MDA含量稍微高于對(duì)照外，其他的10、15、20、25 min處理的幼莖MDA含量都低于對(duì)照，分別比對(duì)照降低了14.58%、13.02%、20.31%、44.27%，其中處理25 min的幼莖MDA含量?jī)H為0.107，顯著低于對(duì)照以及其他4個(gè)處理（P<0.05）。而葉片的MDA含量表現(xiàn)為不規(guī)律的變化，故不做分析。下一步進(jìn)行研究討論。

2.3.3 超聲波處理對(duì)羽扇豆種子可溶性蛋白含量的影響 種子的萌發(fā)離不開(kāi)蛋白質(zhì)的參與，植物體內(nèi)的可溶性蛋白大多數(shù)是各類(lèi)代謝酶類(lèi)，所以可溶性蛋白含量的變化在一定程度上反映了植物體內(nèi)的代謝變化。不同超聲波處理時(shí)間對(duì)羽扇豆幼苗可溶性蛋白含量的影響情況見(jiàn)表2。從表2可見(jiàn)，不同超聲波時(shí)間處理后，羽扇豆幼莖和葉片中的可溶性蛋白含量都高于對(duì)照，在超聲波處理5、10、15、20、25 min后，幼莖的可溶性蛋白含量分別比對(duì)照提高了13.28%、10.96%、27.30%、32.13%、6.10%，其中15、20 min處理的種子，其幼莖可溶性蛋白含量顯著高于對(duì)照（P<0.05）。而葉片中的可溶性蛋白含量在5～15 min處理內(nèi)上升，到15 min達(dá)到最大值，其后則下降，各處理的可溶性蛋白含量與對(duì)照差異不顯著（P>0.05）。

3 討論

超聲波技術(shù)是一種簡(jiǎn)捷實(shí)用、高效環(huán)保的技術(shù)。超聲波的生物學(xué)效應(yīng)主要是由空化作用引起，低強(qiáng)度超聲波作用于種子的細(xì)胞后，能提高細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的穿透性，促進(jìn)種子的新陳代謝。張衛(wèi)華等[9]研究表明，超聲波處理抱莖獐牙菜（Swertia franchetiana H. Smith）種子20～50 min，對(duì)種子的萌發(fā)均有促進(jìn)作用，其中以超聲波處理35 min的效果較好。王劍龍等[10]研究表明，超聲波處理黃精（Polygonatum sibiricum Delar.ex Redoute）種子可以促進(jìn)種子萌發(fā)，以超聲波處理20 min的效果最明顯，處理時(shí)間在10～60 min范圍內(nèi)均有效果，在本試驗(yàn)中，超聲波處理羽扇豆種子時(shí)間在5～25 min范圍內(nèi)，其發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、幼苗重和活力指數(shù)均超過(guò)了對(duì)照，而以處理20～25 min的效果較好，再一次證明超聲波處理可以提高種子活力。但由于種子的大小、形態(tài)、種皮的厚薄各異，超聲波處理種子的最佳時(shí)間也就不同。

抗氧化酶系統(tǒng)可加速對(duì)自由基的清除，減輕自由基對(duì)膜的破壞，有利于膜的修復(fù)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，超聲波處理提高了羽扇豆幼苗的葉片和幼莖的SOD活性，降低了MDA含量，有效減輕了活性氧對(duì)膜的傷害，保護(hù)了膜系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的完整性。超聲波處理后，羽扇豆種子外滲液電導(dǎo)率降低，有利于種子活力的提高。經(jīng)超聲波處理后，羽扇豆種子可以保持較高的抗氧化酶活性，減少M(fèi)DA的積累，保持細(xì)胞膜的相對(duì)完整性，提高了種子的活力。羽扇豆種子發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率提高的機(jī)理可能是通過(guò)提高SOD活性、修復(fù)種子吸脹過(guò)程中引起的膜損傷來(lái)實(shí)現(xiàn)的。由于超聲波是一種彈性機(jī)械波，其生物學(xué)效應(yīng)非常復(fù)雜，既可引起生物分子甚至細(xì)胞損傷，也可促進(jìn)生物大分子的合成及生物體的生長(zhǎng)[11，12]，對(duì)種子既有有益的一面，也有有害的一面，此次超聲波處理時(shí)間試驗(yàn)對(duì)羽扇豆種子的處理是在5～25 min條件下實(shí)施的，處理時(shí)間最長(zhǎng)為25 min，從羽扇豆種子發(fā)芽率來(lái)看，處理25 min與最佳時(shí)間15 min差異不顯著，說(shuō)明超聲波處理25 min還沒(méi)有對(duì)種子造成傷害，但究竟處理多長(zhǎng)時(shí)間才會(huì)對(duì)種子產(chǎn)生傷害，有待進(jìn)一步深入研究來(lái)證實(shí)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 王紅明，郭素娟，賈漢森.超聲波處理對(duì)不同種源紅砂種子萌發(fā)的影響[J].種子，2015，34（1）：19-23.

[2] 史鋒厚，朱燦燦，沈永寶.超聲波與滲透調(diào)節(jié)處理對(duì)油松種子萌發(fā)的影響[J].浙江農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，28（4）：545-549.

[3] 李 剛，王乃亮，羅娘嬌，等.超聲波處理對(duì)當(dāng)歸種子萌發(fā)及活力的影響[J].西北師范大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，43（3）：75-77，84.

[4] 楊紅兵.超聲技術(shù)在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用現(xiàn)狀與前景[J].農(nóng)機(jī)化研究，2004（1）：202-204.

[5] 張福平，鄧有琴.植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)羽扇豆種子發(fā)芽與幼苗生長(zhǎng)的影響[J].種子，2009，28（11）：88-93.

[6] 顏啟傳.種子學(xué)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2001.55-70.

[7] 陳毓荃.生物化學(xué)試驗(yàn)方法和技術(shù)[M].北京：科學(xué)出版社，2006.83-97.

[8] 李合生.植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)[M].北京：高等教育出版社，2000.164-169.

[9] 張衛(wèi)華，董匯澤.超聲波處理抱莖獐牙菜種子萌發(fā)試驗(yàn)研究[J].青海大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，27（2）：57-59.

[10] 王劍龍，常 暉，周仔莉，等.超聲波對(duì)黃精種子萌發(fā)及萌發(fā)生理影響[J].種子，2014，33（1）：30-33.

[11] 趙 艷，楊青松，王 瑩，等.不同時(shí)間超聲波處理對(duì)油菜種子萌發(fā)的影響[J].種子，2012，31（10）：90-92.

[12] 丁志山，沃興德.超聲波的生物學(xué)效用及其在轉(zhuǎn)基因中的應(yīng)用[J].生命科學(xué)，2009，27（4）：187-189.