微波輔助提取白頭翁皂苷研究

摘要：利用響應面法對白頭翁（Pulsatilla chinensis）皂苷的微波提取條件進行了優化。在單因素試驗基礎上，利用Box-Behnken中心組合設計原理及響應面法分析并建立二次回歸模型。以乙醇體積分數、微波功率、微波時間為考察因素，以白頭翁皂苷提取率為響應值，研究了各因素對白頭翁皂苷提取率的影響。確定最佳微波提取條件為乙醇體積分數50%、微波功率300 W、微波時間4 min，在此條件下，白頭翁皂苷提取率達到5.33%。

關鍵詞：白頭翁（Pulsatilla chinensis）；皂苷；微波輔助提取；響應面法

中圖分類號：S567.23+9；R284.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）20-5348-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.20.045

Abstract：The response surface methodology was used to optimize the microwave-assisted extraction conditions of pulchinenoside. Based on the single factor experiment，a quadratic regression model was established using the principle of Box-Behnken central composite design and the response surface method. Taking the ethanol volume fraction，microwave power and irradiation time as investigation factors，and extraction rate of pulchinenoside as response value，the effects of various factors on the extraction rate of pulchinenoside were studied. The optimal extraction conditions determined were ethanol volume fraction of 50%，microwave power of 300 W，and extraction time of 4 min. Under these conditions，the extraction rate of pulchinenoside was 5.33%.

Key words：Pulsatilla chinensis；pulchinenoside；microwave-assisted extraction；response surface methodology

中藥白頭翁為毛茛科植物白頭翁（Pulsatilla chinensis）的干燥根，始載于《神農本草經》，其性味苦寒，具有清熱解毒、涼血止痢、燥濕殺蟲之功效[1，2]。它的化學成分有白頭翁皂苷、胡蘿卜甙、白頭翁素等，主要有效成分為白頭翁三萜皂苷[3，4]。現代藥理研究表明，它具有增強免疫力、抗炎、抗腫瘤、抗病原微生物等作用[5，6]，尤其在抗腫瘤及抗癌的新藥開發方面有很大的應用潛力[7，8]。近年研究還發現其所含的某些活性成分對治療老年性癡呆（阿爾茨海默病）效果顯著[9，10]。

微波輔助提取技術（MAE）利用每秒幾億次周期變化的微波透入物料內，使物料內的各部分在同一瞬間獲得能量促使細胞破裂，使細胞液溢出并擴散到溶劑中，從而達到提取有效成分的目的[11]，具有省時、高效，操作簡便、提取成本低等優點[12]。本研究以白頭翁為原料，白頭翁皂苷B4含量為指標，采用微波輔助溶劑提取白頭翁皂苷，考察了乙醇體積分數、微波功率、微波時間等因素對白頭翁皂苷提取率的影響，并通過響應面法對主要因素進行了優化，旨在為白頭翁皂苷的綜合利用提供借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白頭翁干燥根，購自牡丹江市老百姓大藥房；白頭翁皂苷B4標準品，純度≥98%，貴州迪大生物科技有限公司；甲醇、乙腈（色譜純），JK CHEMICAL LTD公司；甲醇、乙醇（分析純）；水為實驗室自制超純水。

SB-5200DTN型超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；XH-MC-1型實驗室微波合成儀（祥鵠科技發展公司）；Waters 2695型高效液相色譜儀（Waters公司）；Waters 2998型紫外檢測器（Waters公司）；色譜柱（4.6 mm×150 mm）；MF 22R型臺式微量冷凍離心機（美國貝克曼庫爾特公司）；BSA2245S-CW型電子分析天平（德國賽多利斯科學儀器有限公司）；FZ102微型植物粉碎機（蘇州江東精密儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 標準曲線的制作 精密稱取白頭翁皂苷B4標準品3.00 mg，置于5 mL容量瓶中，加入甲醇溶液定容配得濃度為0.600 mg/mL的母液，梯度稀釋為0.600、0.300、0.200、0.100、0.050、0.025 mg/mL的標準品溶液，分別標記為1、2、3、4、5、6，經4 000 r/min離心10 min后，依次取6組標準品溶液，在檢測波長為201 nm，流動相為乙腈∶水∶磷酸（27∶73∶0.1），等度洗脫，洗脫流速為1.0 mL/min；25 ℃柱溫的高效液相色譜條件下進樣10 μL。繪制標準曲線，得出回歸方程。

1.2.2 單因素試驗 將白頭翁干燥根于微型植物粉碎機中粉碎，過50目篩，準確稱取5.0 g，若干份，分別加入一定體積分數的乙醇溶液，配制成不同料液比（g∶mL，下同）的樣品溶液，在一定的微波功率下提取一定的時間，趁熱抽濾，4 000 r/min離心10 min，取上清液入高效液相色譜儀，將得到的峰面積代入回歸方程，依下式計算白頭翁皂苷B4提取率，重復操作3次取平均值，考察不同因素對白頭翁皂苷提取率的影響。

式中，Y為提取率，%；C為目的成分的濃度，mg/mL；V為提取液體積，mL；M為原料重量，g。

1.2.3 響應面試驗設計 綜合單因素試驗的分析結果，選擇乙醇體積分數、微波功率及微波時間為考察因素，以白頭翁皂苷提取率為響應值，利用Box-Behnken設計試驗，見表1。

2 結果與分析

2.1 標準曲線方程

以質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，得到回歸方程為Y=2 586.4X-26.734，R2=0.999 6，白頭翁皂苷在0.025～0.600 mg/mL。

2.2 單因素試驗結果

單因素試驗結果見圖1。初步選定過50目的白頭翁粉末，乙醇體積分數60%、料液比1∶8、微波功率300 W、微波時間4 min為最佳提取條件，采用響應面法對微波輔助提取白頭翁皂苷的條件進行優化。

2.3 響應面試驗結果

2.3.1 回歸模型的建立及方差分析 通過軟件Design expert 7.0對試驗設計及結果（表2）中的試驗數據進行分析，可得到白頭翁皂苷提取率與各個影響因素之間的關系模型為：

Y=5.150-0.021A-0.100B+0.081C-0.031AB-0.410AC+0.490BC-0.500A2-0.620B2-0.160C2

在試驗設計范圍內，對一次項系數進行分析可知，各因素影響順序為：乙醇體積分數<微波時間<微波功率。對模型的各項因素數據進行方差分析，具體結果見表3。由表3可知，整個響應面的回歸方程模型的P值小于0.01，呈極顯著水平，而失擬項F=2.14，P=0.238 1，二者均大于0.05可知，失擬項不顯著，且試驗誤差小，說明這是一項擬合度較高的回歸模型；此外，該模型R2=0.967 5，模型校對系數R2adj=0.925 8，表明模型可以解釋92.58%的響應值變化范圍，因此，該模型可以對微波輔助溶劑法提取白頭翁皂苷效果進行分析和預測。

2.3.2 響應面圖分析 響應面圖形是反映響應值與各個試驗因素之間變化的三維圖形，可從中分析出參數與最佳參數間的相互作用關系[13，14]。基于二次回歸模型進行響應面繪圖，分別給出了各因素間交互影響顯著的響應面圖（圖2）。3個響應曲面均為開口向下的凸形曲面，乙醇體積分數、微波功率、微波時間3個因素與白頭翁皂苷的提取率呈拋物線關系，各因素對白頭翁皂苷提取效果的影響較為顯著，且在考察范圍內存在響應值的極高值。乙醇體積分數在45%～55%，微波功率在250～350 W，微波時間在3～5 min的范圍內有較大的響應值。運用 Design expert 7.0軟件對試驗結果進行優化，得出皂苷提取率最大時乙醇體積分數48.7%、微波功率295.8 W、微波時間4.25 min，考慮到操作的簡便及實際情況，選擇最優條件為微波時間4 min、微波功率300 W、乙醇體積分數50%。采用上述優化條件進行重復試驗，得出實際提取率為5.33%。因此，在實際應用提取時，可利用本研究響應面法優化后的提取條件，該參數可靠、準確、實用。

3 結論

微波輔助溶劑提取法進行了單因素試驗研究，考察了料液比、乙醇體積分數、微波功率、微波時間等因素對白頭翁皂苷提取率的影響，發現微波功率、微波時間、乙醇體積分數的影響較為顯著，因此，利用Design expert 7.0軟件的響應面設計對主要影響因素進行了優化，得出各因素的影響順序：微波功率>微波時間>乙醇體積分數，確定最佳微波提取條件為乙醇體積分數50%、微波功率300 W、微波時間4 min，此條件下白頭翁皂苷提取率達到5.33%。

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