花煙草再生與遺傳轉化體系的建立

摘要：以花煙草（Nicotiana forgetiana）無菌苗植株的葉片為材料，研究不同NAA和6-BA組合培養的再生體系，得到最佳培養基配方為NAA濃度為0.1 mg/L和6-BA濃度為1.5 mg/L， 此時再生率達97%、平均芽數達8.65。以卡那霉素（Km）、頭孢霉素（Cef）為篩選試劑，探討了影響農桿菌介導的花煙草遺傳轉化因素，表明卡那霉素敏感性濃度為20 mg/L、頭孢霉素抑菌濃度為300 mg/L，在菌液OD600 nm為0.2～0.4時最適侵染時間為5 min；最適篩選培養基（MS+0.1 mg/L NAA+1.5 mg/L 6-BA+300 mg/L Cef+20 mg/L Km）、壯芽培養基Z2（MS+0.1 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA+300 mg/L Cef+20 mg/L Km）、生根培養基S2（MS+0.1 mg/L 6-BA+300 mg/L Cef+20 mg/L Km）。以最佳組合進行遺傳轉化培養，獲得的生根苗經煉苗移栽后存活35個株系，用CTAB法提取植物組織DNA，經PCR檢測證實外源基因已轉入植物組DNA中，陽性率為71%。

關鍵詞：花煙草（Nicotiana forgetiana）；再生體系；根癌農桿菌；遺傳轉化體系

中圖分類號：S681.9；Q813.1；Q813.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）20-5384-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.20.055

Abstract： Using leaf disks of Nicotiana forgetiana as explants， the effects of different concentrations of naphthalene-acetic acid（NAA） and 6-benzylamino purine（6-BA） to the regeneration system were explored. Results showed that optimum medium for the highest differentiation rate amounting to 97% and number of per buds up to 8.65 was MS medium with supplement of 0.1 mg/L Using leaf disks of Nicotiana forgetiana as explants，the effects of different concentrations of naphthalene-acetic acid（NAA） and 6-benzylamino purine（6-BA） on the leaf regeneration were analyzed. On the basis of the regeneration medium，the factors affecting the genetic transformation efficiency，such as Kanamycin（Km），Cefotaxime（Cef） and infection duration，were studied. Results suggested that the optimal concentration of Km for callus selecting was 20 mg/L，300 mg/L Cef could control the agrobacterium pollution and suitable infection duration was 5 min. The optimal medium for selecting（MS+0.1 mg/L NAA+1.5 mg/L 6-BA+300 mg/L Cef+20 mg/L Km），induction（MS+0.1 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA+300 mg/L Cef+20 mg/L Km） and rooting（MS+0.1 mg/L 6-BA+300 mg/L Cef+20 mg/L Km） were also selected. Finally，35 transferred plants were obtained，and PCR analysis indicated that the exogenous gene had been integrated into the genome of transformed Nicotiana forgetiana.

Key words：Nicotiana forgetiana； regeneration system； Agrobacterium tumefaciens； genetic transformation system

花煙草（Nicotiana forgetiana）又稱福吉特士煙草，起源于澳大利亞和北美洲[1]，與煙草（Nicotiana tabacum L.）、本氏煙草（Nicotiana benthamiana）等同為茄科煙草屬植物。其株型較小，株高1 m左右，花朵美麗，花色為穩定的洋紅色，從初夏至降霜均可開放，具有較高的觀賞價值，可在園林中普遍應用[2]。國外的報道主要包括其自交不親和機理的研究[3]、與煙草屬中多種野生種共同作為比較基因組學[4]、傳粉生物學[5]、形態進化學[6]的重要研究對象等，如Bissell等[7]研究了煙草屬N. forgetiana與N.alata兩個物種的花朵形態學遺傳規律。但因花煙草的自交不親和性，通常需要人工授粉獲得后代[8]，較耗費時力，而組培再生能夠為其獲得大量材料提供簡單可靠的途徑。

自Horseh等[9]首次以煙草為材料獲得轉基因植株以來，越來越多不同植物材料的遺傳轉化得以研究和應用[10，11]，為不同需求的基因功能分析提供了有效途徑[12，13]。普通煙草、本氏煙草等的再生與遺傳轉化體系不斷更新完善[14-17]，成為觀賞植物，尤其是木本觀賞植物轉基因功能驗證的模式材料[18，19]。但是普通煙草的株型較大，占地多，不便于整體的開花調控；其花色易受光照、溫度、濕度等環境因素的影響，容易干擾花色相關基因的結果[20]。相比而言，花煙草株型較小，花色為穩定的花煙草，便于管理和花色相關基因研究，但是至今鮮見其再生及遺傳轉化體系的報道。因此，以花色穩定且株型較小的觀賞花煙草為材料，建立其再生及遺傳轉化體系，可為觀賞植物花色基因的研究提供一種新的轉基因模式材料。

1 材料與方法

1.1 材料

花煙草無菌苗，來源于華中農業大學園藝植物生物學教育部重點實驗室所建立的無菌苗株系，以40～50 d的花煙草葉片作為轉化的受體材料。

MYB目的基因來源于桂花（Osmanthus fragrance），供試質粒為pCAMBIA2300s，含CaMV35S啟動子及卡那霉素抗性基因；轉化受體菌株為根癌農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105，由華中農業大學園藝植物生物學教育部重點實驗室保存提供。檢測正向引物為35S-F：ACGCACAATCCCACTATCCTTC。

頭孢霉素（Cef）、卡那霉素（Km）、利福平（Rif）采用過濾滅菌，生長素NAA、細胞分裂素6-BA均用121 ℃下高溫高壓蒸汽滅菌。農桿菌培養基主要有LB+Km固體培養基、LB+Km+Rif液體培養基和MS液體培養基。

1.2 再生培養基的篩選

將40～50 d的無菌苗葉盤，接種于不同植物生長調節劑組合（A-F）的培養基（表1），在（25±2） ℃、16 h/d光照條件下培養，每個處理30個外植體， 30 d后統計再生率和平均芽數。

不定芽再生率=再生不定芽的外植體總數/接種外植體總數×100（%）；平均芽數=外植體再生不定芽總數/再生不定芽外植體總數。

1.3 遺傳轉化體系的建立

1.3.1 抗生素敏感性試驗及頭孢霉素抑菌濃度的確定 卡那霉素濃度篩選：配制卡那霉素0、10、20、30、40和50 mg/L的再生培養基，將30～50 d的無菌苗葉盤接種于不同的培養基上，在（25±2） ℃、16 h/d光照條件下培養，30 d后統計不定芽再生率和平均芽數。

頭孢霉素抑菌濃度的確定。配置頭孢霉素100、200、300、400 mg/L及20 mg/L卡那霉素的篩選培養基。葉盤侵染5 min后接種于不同的培養基上，30 d后統計菌落和葉盤再生情況。

1.3.2 農桿菌的培養與菌液準備 在含卡那霉素的固體培養基上平板劃線，避光培養3 d。挑取單克隆置于含Km和Rif的LB液體培養基中（5 mL），28 ℃、200 r/min振蕩培養至培養基顏色由酒紅色變為橙紅色。再進行繼代培養，取1 mL菌液于50 mL培養基中，同樣條件下培養至培養基顏色由酒紅色變為淺橙紅色，用分光光度計測定OD600 nm，OD600 nm為0.2～0.4左右可用。將菌液置于50 mL無菌的離心管4 ℃條件下4 000 r/min離心10 min，棄上清液，加入50 mL MS液體培養基，振蕩使菌液重懸，28 ℃條件下200 r/min培養1 h即可。

1.3.3 葉盤的侵染 將無菌苗葉盤在重懸后的菌液中進行侵染，侵染時間設置梯度為2、5、8和 11 min，侵染完成后，用無菌濾紙吸干葉片表面的菌液，暗培養3 d。

1.3.4 侵染后的培養 暗培養完成后，用含有Cef（300 mg/L）的無菌水清洗葉片8 min，再用無菌水清洗2～3遍，無菌濾紙吸干后，放入篩選培養基中培養。每隔15 d繼代1次，直到長出小芽，再放入壯芽培養基（Z1、Z2）中培養。Z1（MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+300 mg/L Cef+20 mg/L Km）和Z2（MS+0.1 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA+300 mg/L Cef+20 mg/L Km）。小芽長出3～4片葉時，切下放入生根培養基（S1、S2）中培養。S1（1/2 MS+0.1 mg/L 6-BA+300 mg/L Cef+20 mg/L Km）和S2（MS+0.1 mg/L 6-BA+300 mg/L Cef+20 mg/L Km）。培養室設置為（25±2） ℃、16 h/d光照。

1.3.5 生根苗的煉苗及移栽 將已生根且根長約2～3 cm、株高3～4 cm的葉片鮮綠組織培養壯苗帶瓶移到光照培養箱中，選擇光照適中的區域打開瓶蓋，進行2～3 d光適應。然后將根洗凈移栽于裝有基質的小缽中，基質全部用清水浸濕，第一次澆水澆透，之后每隔2～3 d澆水1次，使基質見干見濕，至新根新葉發出，即移栽成活。

1.4 轉基因花煙草的PCR檢測

取篩選獲得的轉基因植株葉片，采用CTAB法提取植物組織總DNA，用CaMV35S啟動子上游引物和MYB目的基因下游引物進行PCR擴增。擴增體系為5 μL Es Taq Mix、35S-F和MYB-R各0.5 μL、1 μL DNA模板、3 μL去離子水。PCR擴增條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 S，60 ℃退火30 S，72 ℃延伸1 min，35個循環；72 ℃延伸10 min。擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測分析。設置供試質粒為陽性對照，野生型花煙草為陰性對照，計算陽性率。

2 結果與分析

2.1 不同植物生長調節劑組合對葉盤再生的影響

30 d后統計葉片再生情況發現，葉盤在NAA和6-BA不同濃度配比的培養基中再生率差別較大（表2、圖1）。其中，B組合即當NAA濃度為0.1 mg/L、6-BA濃度為1.5 mg/L時，誘導效果最好，再生率達97%，平均芽數達8.65。葉盤1周左右開始誘導形成愈傷組織，2周后開始分化形成芽點，4周后芽點萌發形成整齊一致的叢生芽，適合作為遺傳轉化材料。

2.2 卡那霉素敏感性濃度及頭孢霉素（Cef）抑菌濃度的確定

在預試驗階段，用50、100 mg/L的卡那霉素濃度進行篩選比較，花煙草葉盤在培養至20 d時已全部褐化。在此基礎上設計含有0、10、20、30、40和50 mg/L卡那霉素再生培養基進行篩選比較。結果表明，花煙草葉盤對卡那霉素反應比較敏感（表3、圖2）。當卡那霉素濃度為20 mg/L時，愈傷組織褐變率為90.9%，出芽率為2.0%，極少部分葉盤及愈傷組織能夠維持綠色，并分化出部分綠芽。當卡那霉素濃度大于20 mg/L時，葉盤基本全部褐化，無法分化出綠芽。一般確定篩選濃度要略低于臨界致死濃度，因此，本試驗確定卡那霉素敏感性濃度為20 mg/L。

當頭孢霉素濃度為300 mg/L時，基本能夠抑制農桿菌的生長，且再生率最高為71.0%，當其濃度繼續升高時，葉盤再生率下降，說明頭孢霉素濃度過高時會抑制葉盤的生長（表4）。因此選擇300 mg/L作為頭孢霉素抑菌的適宜濃度。

2.3 農桿菌菌液侵染時間的確定

侵染時間是影響農桿菌侵染效果的重要因素，前人的研究中侵染時間從30 s到30 min均有采用[21]，其差異可能源于品種基因型不同。在菌液濃度基本一致（OD600 nm為0.2～0.4）的情況下，參照普通煙草的最佳侵染時間，設計梯度為2、5、8、11 min進行試驗。結果表明，侵染時間以5 min為宜，當侵染時間過短時，農桿菌無法有效附著，則會降低轉化植株的陽性率，當侵染時間過長時，葉盤容易被農桿菌污染，并可能在長時間內產生反菌現象，影響葉盤愈傷組織的形成和綠芽的分化（圖3）。

2.4 壯芽、生根培養基的優化

2.4.1 壯芽培養基的優化 一般而言，篩選培養基分化出的小芽在壯芽培養基中培養一段時間后，再轉入生根培養基中，更容易生根存活。在預試驗階段已經篩選出兩種待選壯芽培養基，分別為Z1（MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+300 mg/L Cef+20 mg/L Km）和Z2（MS+0.1 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA+300 mg/L Cef+20 mg/L Km）。培養15 d后，兩種培養基中小芽的生長狀況見表5。Z1培養基中小芽能夠繼續生長，部分帶葉盤或愈傷組織的小芽能夠持續分化，形成更多的小芽，但是生根率較低。Z2培養基中大部分小芽開始生根，但是根系并不發達。Z2培養基生根率更高，效果更好，因此選擇Z2用于后續試驗。

2.4.2 生根培養基的優化 采用兩種生根培養基S1（1/2 MS+0.1 mg/L 6-BA+300 mg/L Cef+20 mg/L Km）和S2（MS+0.1 mg/L 6-BA+300 mg/L Cef+20 mg/L Km）。結果表明，雖然兩者的生根率都偏低，而且生根緩慢，但是S2的生根率明顯高于S1，且S2培養基中的小芽生長相對較快，小芽褐化率低（表6），選定S2作為生根培養基。

2.5 轉基因花煙草的分子檢測

用CTAB法提取經生根培養基篩選獲得的部分抗性單株的DNA，并用PCR擴增法進行陽性檢測（圖4）。結果表明，在轉化植株DNA中擴增出單一的目的條帶，大小與預測大小一致；而未轉化植株則沒有，證實外源基因已轉入花煙草DNA中。在經生根培養獲得的35個抗性株系中，陽性株系為25個，陽性率為71.0%。

3 小結與討論

本研究初步建立了花煙草再生與遺傳轉化體系。與普通煙草相比，其再生率、各種植物生長調節劑使用濃度和比例、卡那霉素敏感性濃度、篩選濃度、侵染時間及生根率等都有差別[14-17]。NAA和6-BA的濃度比例是葉片再生和芽萌發率的關鍵，對于不同植物種類或品種，兩者的濃度比例呈現不同的效果。當NAA為0.1 mg/L，6-BA為1.5 mg/L時，花煙草的誘導效果最好，再生率達97%，平均芽數達8.65。當6-BA不變而NAA濃度升高時，再生率和平均綠芽數呈下降趨勢。相比常用的普通煙草再生體系0.3 mg/L NAA與2.25 mg/L 6-BA，其濃度較低，6-BA與NAA的比例較高[16]。而與本氏煙草再生體系NAA 0.1 mg/L、6-BA 1.5 mg/L的比例基本一致，這可能與植物不同的基因型相關[15]。

在植物遺傳轉化過程中，所構建的載體、篩選濃度等因素對植物的轉化效率有很重要的影響[21，22]。其中，載體的影響尤為重要，因不同載體其所攜帶的篩選抗生素的種類不同，而試驗選用的篩選抗生素的種類在很大程度上決定了轉化效率的高低。在有關煙草屬轉化的報道中，大部分遺傳轉化試驗采用以卡那霉素為篩選抗生素的載體，篩選效果良好[14，16，17]。本研究采用以卡那霉素為篩選抗生素的載體，獲得卡那霉素最適篩選濃度為20 mg/L，與普通煙草相比，其對卡那霉素的敏感性較高，篩選濃度較低。此外，采用頭孢霉素為抑菌試劑，獲得適宜抑菌濃度為300 mg/L。與普通煙草使用的400 mg/L相比，濃度偏低[16]。

在篩選壯芽、生根培養基的試驗中，低濃度的NAA和6-BA促進小芽在壯芽培養基上產生部分根系，全MS營養比1/2MS營養供給更有利于植株產生發達的根系。一般而言，轉基因植株會因難以生根而較難存活，會在一定程度上阻礙試驗的整體進展，也會降低遺傳轉化體系的穩定性[21]。在煙草屬的遺傳轉化中較理想繁榮其生根率和移栽存活率達到了90%以上[17]，而本試驗的2種生根培養基中植株的生根率都相對較低，對生根培養基以及提高移栽成活率需要進一步研究。

本研究初步建立了花煙草再生與遺傳轉化體系。在再生體系中，適宜組合為0.1 mg/L NAA與1.5 mg/L 6-BA。在遺傳轉化體系中，卡那霉素敏感性濃度為20 mg/L，抑菌抗生素頭孢霉素為300 mg/L，在菌液侵染濃度OD600 nm為0.2～0.4時，適侵染時間為5 min。最適篩選培養基為MS+0.1 mg/L NAA+1.5 mg/L 6-BA+300 mg/L Cef+20 mg/L Km，最適壯芽培養基為MS+0.01 mg/L NAA+0.1 mg/L 6-BA+300 mg/L Cef+20 mg/L Km，最適生根培養基為MS+0.1 mg/L 6-BA+300 mg/L Cef+20 mg/L Km。獲得的生根苗經煉苗移栽后存活35個株系，用CTAB法提取植物組織DNA，經PCR檢測初步證實外源基因已轉入植物組DNA中，本研究為后續的MYB基因功能驗證奠定了基礎。

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