日糧蛋白水平對豬糞惡臭化合物及細菌生態的影響（續完）

中圖分類號：S828 文獻標識碼：C 文章編號：1001-0769（2016）07-0075-03

3 結果

3.1 日糧粗蛋白水平對糞便中惡臭化合物濃度的影響

在粗蛋白水平為20 %、17、5 %和15 %的處理組中，酚含量分別為24.03 mg/L、28.84 mg/L和15.58 mg/L（P<0.05），吲哚含量為3.67 mg/L、3.04 mg/L和2.12 mg/L（P<0.05）。15 %粗蛋白組具有最低的酚和吲哚濃度，與粗蛋白20 %的試驗組相比，酚濃度降低35 %，吲哚濃度降低42 %。乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸和異戊酸等揮發性脂肪酸的濃度隨日糧粗蛋白含量增大而提高，15 %粗蛋白組的SCFA和BCFA含量最低（表2）。

3.2 日糧粗蛋白水平對糞便中菌落組成變化的影響

焦磷酸測序數據：20 %粗蛋白組和15 %粗蛋白組的所有測序reads分別有9 858和13 167個序列。在去除低質量reads后，有7 824（20 %粗蛋白組）和11 156（15 %粗蛋白組）個細菌reads用于后續分析（表3）。在剪去PCR引物后，20 %粗蛋白組和15 %粗蛋白組的平均reads長度分別為505和500。

雖然15 %粗蛋白組中細菌reads數高于 20 %粗蛋白組，但OTUs數量、多樣性（香農指數）和豐度（Chao1）卻低于20 %粗蛋白組。這一結果表明，15 %粗蛋白組的菌落比20 %粗蛋白組簡單。

細菌分類學組成：在門這個分類層面，主要是厚壁菌門，相對豐度比例超過70 %，其次是擬桿菌和變形菌門。厚壁菌門的相對豐度不受日糧處理影響。15 %粗蛋白組的擬桿菌相對豐度（3.3 %）低于20 %粗蛋白組（12.1 %，P<0.05），而20 %粗蛋白組的變形菌豐度（6.8 %）低于15 %粗蛋白組（12.1 %，P<0.05）。在屬這個分類層面可看出更細微的差異。其中15 %粗蛋白組中（厚壁菌門）芽孢桿菌綱的鏈球菌屬、芽孢桿菌屬和肉桿菌屬，（厚壁菌門）梭菌綱的嗜胨菌屬和瘤胃菌屬，（擬桿菌門）擬桿菌綱的擬桿菌屬，（變形菌門）變形菌綱的假單胞菌均低于20 %粗蛋白組，而（厚壁菌門）芽孢桿菌綱的腸球菌屬、（厚壁菌門）梭菌綱的梭狀芽孢桿菌屬和（變形菌門）變形菌綱的叢毛單胞菌屬高于20 %粗蛋白組。

3.4 細菌屬的相對豐度與糞便惡臭化合物的相關性

酚、吲哚、異丁酸和異戊酸與肉桿菌屬、對甲酚和糞臭素與擬桿菌屬、乙酸和丁酸與紫單胞菌科AM982595屬以及丙酸與組織菌屬之間存在顯著的相關性。

4 討論

由于微生物厭氧分解營養素生成惡臭化合物，因此減少營養素的排出對減少惡臭至關重要。尤其是氮的排出是生成惡臭化合物的主要原因。

日糧粗蛋白水平從18 %降低至12 %，生長豬和肥育豬糞便中酚、吲哚、SCFA和BCFA等惡臭化合物生成減少40 %。我們的研究發現，與 20 %粗蛋白試驗組相比，15 %粗蛋白組中酚、吲哚、SCFA和BCFA的含量降低35～40 %。酚、吲哚和BCFA比其他化合物具有更高的臭氣強度及更低的氣味檢測閾值。從豬舍、糞便存放地以及施肥土壤中散發出來的吲哚、對甲酚和糞臭素占所有揮發性有機化合物（VOCs）氣味活性值的90 %以上，尤其是對甲酚，是VOC排放惡臭的最重要因素。

未消化的日糧蛋白和內源性蛋白通過胃腸道，加速可發酵蛋白質的細菌增殖，生成潛在的惡臭化合物如酚、吲哚和BCFA。在大腸吸收的酚和吲哚隨后與肝臟中的葡糖醛酸結合，并通過尿液以葡糖苷酸形式排出。在糞便中，尿葡糖苷酸通過糞便β-葡萄糖醛酸酶催化水解，釋放出酚和吲哚。有報道指出，日糧蛋白質攝入量和尿液酚排出之間存在正相關。降低日糧粗蛋白水平，使得氮排放減少，從而降低豬糞便中細菌的發酵。因此，日糧粗蛋白水平從20 %降低到15 %，可能減少蛋白質發酵期間代謝的酚、吲哚和BCFA。

與細菌培養技術計數相比，焦磷酸測序技術無需培養，可提供更為準確的菌落信息。基于 16s rRNA基因序列的多重bar-coded焦磷酸測序技術能夠識別低至1 %的菌落。因此，這種技術已被用于分析大腸和糞便中的多種細菌，并用于解釋與惡臭化合物生成有關的新菌落。

來源于蛋白質的氮和氨基酸為分解糖和不分解糖的細菌生長提供能量來源。提供過量日糧蛋白可導致多種腸道細菌大量增殖，因為過量或未消化的蛋白質被用作細菌發酵的底物。我們發現，15 %粗蛋白組中菌群多樣性低于20 %粗蛋白組，這表明這些菌群對豬日糧蛋白水平的細微變化非常敏感。

與以前的研究相似，本研究中細菌分類情況表明，厚壁菌、擬桿菌以及變形菌是主要的細菌類別。構成大多數腸道細菌的厚壁菌和擬桿菌數與碳水化合物和蛋白質代謝有關。這兩個門的細菌被用作進化標記物，因為其豐度容易受胃腸道中發酵條件的影響。在我們的研究中，與15 %粗蛋白組相比，20 %粗蛋白組的擬桿菌相對豐度較高，但變形菌豐度較低。

細菌豐度的改變與豬糞中生成的惡臭化合物組成有關。擬桿菌在進行脫氨基和脫羧基過程中，可生成最為惡臭的化合物之一糞臭素。與此相反，糞臭素含量較高的樣品中，變形菌相對豐度較低。大多數細菌在代謝氨基酸時會生成VFA、酚和吲哚。擬桿菌、丙酸桿菌、梭狀芽孢桿菌、真桿菌和鏈球菌將甘氨酸、丙氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、賴氨酸和天冬氨酸代謝為乙酸。氨基酸的微生物代謝也會生成其他揮發性脂肪酸，比如谷氨酸和賴氨酸會生成丁酸，丙氨酸和蘇氨酸生成丙酸，纈氨酸生成異丁酸，亮氨酸和異亮氨酸生成異戊酸。此外，擬桿菌、乳桿菌、雙歧桿菌、梭菌以及消化鏈球菌通過代謝芳香化合物如酪氨酸和色氨酸生成酚和吲哚。念球菌、芽孢桿菌、肉桿菌、擬桿菌及假單胞菌將色氨酸代謝為吲哚-3-乳酸，并在糞便中分解為吲哚和糞臭素。我們的研究發現，15 %粗蛋白組中，生成吲哚和糞臭素的成分含量低于20 %粗蛋白組。此外，芽孢桿菌、擬桿菌和假單胞菌通過支鏈氨基酸如亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸的脫氨基作用生成BCFA。擬桿菌類分泌各種大量的蛋白酶，分解內源性和外源性蛋白。細菌蛋白酶的行為類似于彈性蛋白酶，會破壞刷狀緣的麥芽糖酶和蔗糖酶。嗜胨菌作為不分解糖的細菌可利用蛋白質作為能量來源，并生成BCFA和吲哚。與擬桿菌相比，在15 %粗蛋白組中含量更高的梭菌生成的SCFA、BCFA和吲哚的量少于高蛋白組（20 %）。這些結果表明，改變日糧蛋白水平可調節菌落組成和相對菌群豐度。

酚、吲哚、異丁酸和異戊酸與肉桿菌存在強烈的正相關。肉桿菌可將纈氨酸和色氨酸代謝為BCFA和吲哚，并與雞糞中VOC中酚類存在強烈的正相關。擬桿菌是革蘭氏陰性和專性厭氧菌屬，提供了對疏水性分子有效的屏障，因此可將疏水性氨基酸，包括色氨酸和酪氨酸以及芳香氨基酸代謝為酚、吲哚及其前體。對甲酚和糞臭素的生成也與擬桿菌呈現正相關。我們發現乙酸和丁酸與紫單胞菌科、丙酸與組織菌之間也存在強烈的正相關。紫單胞菌科細菌生成多種揮發性有機物，如該科的蛋白水解菌從多種氨基酸產生乙酸、丙酸和丁酸。組織菌是一種革蘭氏陽性菌，最初從人糞便中分離，可產生乙酸，是分解肌酸酐的中間物質。這些結果表明，肉桿菌及擬桿菌與酚、吲哚和BCFA等惡臭化合物之間存在強烈的正相關。

5 結論

本研究結果表明，調整日糧粗蛋白水平會影響惡臭化合物及微生物菌群的組成。添加15 %的粗蛋白而不是20 %的粗蛋白可顯著降低豬糞中惡臭化合物。焦磷酸測序分類分析表明，惡臭化合物和菌群之間存在強相關。更進一步的研究將側重查明細菌代謝的確切機制，并在豬舍中應用惡臭生成的預測模型。