板藍(lán)根多糖在C57小鼠抗結(jié)核感染中的作用*

向 田，劉 杲，楊 瑾

1 恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院，湖北 恩施 445000；2 湖北民族學(xué)院中醫(yī)學(xué)院

板藍(lán)根多糖在C57小鼠抗結(jié)核感染中的作用*

向 田1，劉 杲1，楊 瑾2

1 恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院，湖北 恩施 445000；2 湖北民族學(xué)院中醫(yī)學(xué)院

目的：探討板藍(lán)根多糖對結(jié)核感染小鼠的作用及其機(jī)制。方法：提取板藍(lán)根多糖配制成懸液后尾靜脈注射感染毒性結(jié)核分岐桿菌H37Rv C57小鼠，按照50 mg/kg的量對板藍(lán)根多糖治療組小鼠腹腔注射板藍(lán)根多糖溶液，連續(xù)注射1周，對照組注射等量的生理鹽水。觀察比較各組小鼠的生存率，脾臟、肺臟的病理變化及抗酸染色分析菌落數(shù)，用酶聯(lián)免疫吸附法測定小鼠脾臟細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子，流式細(xì)胞術(shù)檢測脾臟CD4、CD8陽性T細(xì)胞比例。結(jié)果：經(jīng)板藍(lán)根多糖治療的結(jié)核感染小鼠，生存率較對照組明顯提高，脾臟及肺臟的病理變化減輕，肺臟菌落數(shù)較對照組明顯降低，脾臟細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IFN-γ水平提高，白細(xì)胞介素-4(IL-4)變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，CD8 T細(xì)胞比例升高。結(jié)論：板藍(lán)根多糖能夠通過刺激Th1型細(xì)胞因子的產(chǎn)生進(jìn)而增強(qiáng)C57小鼠的細(xì)胞免疫應(yīng)答來抗結(jié)核分岐桿菌的感染。

結(jié)核分岐桿菌；Th1型細(xì)胞因子；細(xì)胞免疫；板藍(lán)根多糖

目前，結(jié)核病仍然是威脅人類生命健康的重要傳染病之一，全球每年因結(jié)核病死亡約200萬人，每年有約800萬結(jié)核病新發(fā)病例［1］。近年來，隨著免疫缺陷病毒(HIV)的流行傳播以及結(jié)核分岐桿菌耐藥株的不斷出現(xiàn)，導(dǎo)致全球結(jié)核病疫情更加嚴(yán)峻，被稱為21世紀(jì)的癌癥［2-3］。我國肺結(jié)核患者中耐藥率達(dá)8.32%［4］，給結(jié)核病的治療帶來了更為嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，因此急需開發(fā)新的抗結(jié)核病的治療藥物。

板藍(lán)根為十字花科植物菘籃和草大青的根，含有谷氨酸、精氨酸等多種氨基酸以及豐富的多糖成分(板藍(lán)根多糖)［5］。相關(guān)研究［6-9］表明，板藍(lán)根具有較好的抗菌、抗病毒作用，對大腸桿菌、痢疾桿菌、金黃色葡萄球菌、流感病毒以及非典型肺炎病毒(SARS病毒)等有較好的抑制作用；同時(shí)有研究［10-11］進(jìn)一步證實(shí)板藍(lán)根多糖可顯著提高小鼠免疫功能，對氫化可的松所致免疫功能抑制小鼠脾指數(shù)、白細(xì)胞總數(shù)和淋巴細(xì)胞數(shù)的降低有明顯對抗作用；此外，板藍(lán)根多糖還能明顯增強(qiáng)抗體形成細(xì)胞功能［12］。

基于此，本研究將提取的板藍(lán)根多糖應(yīng)用于毒性結(jié)核分岐桿菌H37Rv感染的C57小鼠模型，以觀察板藍(lán)根多糖對抗結(jié)核感染的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物雌性C57小鼠，體質(zhì)量18～20 g，購自武漢大學(xué)ABSL-3實(shí)驗(yàn)動物中心，實(shí)驗(yàn)動物合格證號：42000600013383，在該動物中心SPF級環(huán)境中飼養(yǎng)并完成所有實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物及試劑板藍(lán)根顆粒(湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院楊瑾老師惠贈)；毒性結(jié)核分岐桿菌H37Rv(武漢市醫(yī)療救治中心提供)；小鼠IFN-γ、IL-4的ELISA試劑盒(購自eBioscience公司)；7H9結(jié)核培養(yǎng)基(購自BD公司)；小鼠FITC標(biāo)記的CD4抗體、PE標(biāo)記的CD8抗體(均購自eBioscience公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 結(jié)核感染小鼠及分組 取7H9結(jié)核培養(yǎng)基中的結(jié)核分岐桿菌H37Rv并計(jì)數(shù)，將濃度調(diào)整為5×107CFU/mL，每只小鼠取100 μL進(jìn)行尾靜脈感染。感染后第5天將C57小鼠分為板藍(lán)根多糖治療組及磷酸鹽緩沖溶液(Phosphote buffer，Saline，PBS)對照組，每組12只，并設(shè)正常組12只。同時(shí)按照50 mg/kg的量對板藍(lán)根多糖治療組小鼠腹腔注射板藍(lán)根多糖溶液，連續(xù)注射1周，對照組注射等量的PBS。從治療開始后每天觀察小鼠的生存情況，連續(xù)觀察30天并做記錄。

1.3.2 脾臟、肺臟HE染色 30天后將小鼠頸椎脫臼處死后解剖分離脾臟和肺臟，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片后行常規(guī)HE染色，顯微鏡下觀察。

1.3.3 菌落計(jì)數(shù) 無菌條件下取2組小鼠肺組織，然后按每1 g質(zhì)量的肺組織加1 mL生理鹽水，研磨成勻漿；以此原液作10倍梯度稀釋；選取3個稀釋度的懸液100 μL，分別涂布于改良羅氏培養(yǎng)基上，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16天后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.3.4 ELISA法分別檢測小鼠脾細(xì)胞IFN-γ以及IL-4 無菌條件下取小鼠脾臟，然后按每1 g組織加1 mL含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，無菌研磨并過濾成單細(xì)胞懸液；將脾細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)48小時(shí)后，收集培養(yǎng)上清，按照ELISA試劑盒說明檢測上清中IFN-γ以及IL-4的表達(dá)。

1.3.5 小鼠脾臟CD4、CD8T細(xì)胞比例檢測 將小鼠眼球放血，將血收集于含25 U/mL肝素的EP管中，然后同時(shí)加入5 μL的FITC標(biāo)記的抗鼠CD4以及PE標(biāo)記的抗鼠CD8抗體，避光室溫孵育30分鐘，破除紅細(xì)胞后上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用GraphPad Prism軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以(±s)表示，采用配對t檢驗(yàn)，秩和檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 C57小鼠生存率在毒性結(jié)核分岐桿菌H37Rv感染后第8天，PBS對照組小鼠開始死亡，到第20天，已經(jīng)死亡一半，第30天僅2只存活；而板藍(lán)根多糖治療組小鼠在第14天開始死亡，第30天有7只存活(P=0.0209)，見圖1。

2.2 小鼠脾臟、肺臟HE染色變化情況將小鼠脾、肺分別做HE染色后發(fā)現(xiàn)(放大倍數(shù)為100倍)，經(jīng)板藍(lán)根多糖多次治療的結(jié)核感染小鼠脾臟淋巴多而集中，肺臟結(jié)構(gòu)基本完整；而PBS對照組與正常組小鼠脾臟比較，淋巴分散甚至消失，肺泡融合及實(shí)變嚴(yán)重，見圖2。

圖2 小鼠脾臟、肺臟HE染色情況

2.3 小鼠肺臟菌落計(jì)數(shù)菌落計(jì)數(shù)(每mg log 10 CFU/mL)結(jié)果顯示板藍(lán)根多糖治療組為(5.52± 0.1778)CFU/mL，明顯少于 PBS對照組(8.96± 0.1005)CFU/mL(P=0.0022)，見圖3。

圖3 小鼠肺臟菌落計(jì)數(shù)

2.4 小鼠脾細(xì)胞IFN-γ以及IL-4變化情況 無菌制備小鼠脾細(xì)胞，收獲培養(yǎng)上清后測定IFN-γ以及IL-4的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)板藍(lán)根多糖治療組小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ表達(dá)增加(P＜0.0001)，而IL-4無明顯變化(P=0.1320)，見圖4。

2.5 小鼠脾細(xì)胞中CD4+T細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞比例經(jīng)板藍(lán)根多糖治療的結(jié)核感染小鼠脾臟CD8+T淋巴細(xì)胞增多，與PBS對照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.005)，見圖5。

圖4 小鼠脾細(xì)胞IFN-γ以及IL-4變化

圖5 小鼠脾細(xì)胞中CD4+T細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞比例

3 討論

板藍(lán)根是常用的清熱解毒類中藥，多糖是其發(fā)揮各種治療作用的重要成分之一［13］。臨床上常用來預(yù)防或治療流行性感冒病毒、乙肝病毒、乙型腦炎病毒等病毒感染［14-15］。同時(shí)，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，板藍(lán)根具有一定的抗腫瘤作用，如梁永紅等［16］發(fā)現(xiàn)板藍(lán)根可以抑制肝癌BEL-7402細(xì)胞及卵巢癌細(xì)胞A2780的增殖等；大量研究證實(shí)，板藍(lán)根是一種具有廣譜抗菌作用的藥物，包括抗金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、肺炎球菌、傷寒桿菌等。鄭劍玲等［17］證實(shí)板藍(lán)根各級提取物包括乙醇提取液、正丁醇萃取液等對金黃色葡萄球菌具有很好的抑制作用。

另外，板藍(lán)根在抗菌的同時(shí)能夠增強(qiáng)動物機(jī)體的免疫功能。實(shí)驗(yàn)證明板藍(lán)根多糖對特異性、非特異性免疫細(xì)胞免疫均有促進(jìn)作用，腹腔注射板藍(lán)根多糖(50 mg/kg)可顯著增強(qiáng)小鼠的免疫功能。夏新中等［18］將板藍(lán)根多糖多次腹腔注射感染毒性鼠傷寒桿菌的小鼠后發(fā)現(xiàn)，板藍(lán)根多糖可以通過增強(qiáng)小鼠的體液免疫、細(xì)胞免疫進(jìn)而顯著延長小鼠的生存率。張紅英等［19］以板藍(lán)根多糖作為免疫增強(qiáng)劑聯(lián)合豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗免疫仔豬，證明板藍(lán)根多糖能顯著提高仔豬外周血中CD8+淋巴細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，增強(qiáng)豬對常規(guī)滅活病毒疫苗的免疫應(yīng)答能力。

本研究首次將板藍(lán)根多糖應(yīng)用于小鼠的結(jié)核感染模型中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，以50 mg/kg的量腹腔注射結(jié)核感染的小鼠后，與生理鹽水對照組相比，板藍(lán)根多糖治療組可以顯著延長結(jié)核感染小鼠的生存率；小鼠脾、肺分別做HE染色后發(fā)現(xiàn)，經(jīng)板藍(lán)根多糖多次治療的結(jié)核感染小鼠脾臟淋巴多而集中，肺臟結(jié)構(gòu)基本完整；而生理鹽水對照組與正常小鼠脾臟比較，病理變化較重，淋巴分散甚至消失，肺泡融合及實(shí)變嚴(yán)重；小鼠肺臟菌落計(jì)數(shù)顯示，板藍(lán)根多糖治療組小鼠肺臟菌落數(shù)明顯少于生理鹽水對照組；進(jìn)一步免疫學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，板藍(lán)根多糖可以促進(jìn)結(jié)核感染小鼠脾臟細(xì)胞Th1型細(xì)胞因子IFN-γ的分泌，對Th2型細(xì)胞因子IL-4的分泌幾乎沒有影響；同時(shí)，板藍(lán)根多糖還可增加小鼠脾臟CD8+T的比例。以上研究結(jié)果初步證明，板藍(lán)根多糖可能通過活化CD8+T細(xì)胞以及促進(jìn)Th1型細(xì)胞因子的產(chǎn)生發(fā)揮抗結(jié)核感染作用，其抗結(jié)核的具體機(jī)制還需進(jìn)一步探討。

［1］ Dye C，Scheele S，Dolin P，et al.Consensus statement. Global burden of tuberculosis：estimated incidence， prevalence，and mortality by country.WHO Global Surveillance and Monitoring Project［J］.JAMA，1999，282(7)：677-686.

［2］ Anon.China takes action against tuberculosis and HIV co-infection［J］.Lancet，2010，376：488.

［3］ Migliori GB，Sotgiu G，Lange C，et al.Extensively drugresistant tuberculosis：back to the future［J］.Eur Respir J，2010，36(3)：475-477.

［4］ 成詩明.我國結(jié)核病研究概況［J］.中國防癆雜志，2011，33(9)：525-526.

［5］ 王蓓.板藍(lán)根的基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用［J］.廣西民族大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2006，12：119-130.

［6］ 胡淑平，丁濤，張殿文，等.復(fù)方板藍(lán)根含片的抗菌作用及對免疫功能的影響［J］.中藥藥理與臨床，2007，23(5)：188-190.

［7］ 孔維軍，趙艷玲，山麗梅，等.微量熱法研究板藍(lán)根中四種有機(jī)酸對微生物生長代謝的影響［J］.生物工程學(xué)報(bào)，2008，24(4)：646-650.

［8］ 王瑞軍.幾種中草藥對金黃色葡萄球菌體外抑制作用的研究［J］.現(xiàn)代食品科技，2009，25(9)：1104-1106.

［9］ 胡興昌，鄭偉強(qiáng).板藍(lán)根粗提液抑制流感病毒的實(shí)驗(yàn)研究［J］.上海師范大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，32(1)：62-65.

［10］李苑，陳亦，胡興昌.板藍(lán)根枸杞提取液對小鼠免疫機(jī)能影響的比較［J］.上海師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2006，35(5)：83-86.

［11］儲岳峰，李祥瑞，胡元亮.9種中藥成分對小鼠免疫細(xì)胞活性的影響［J］.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，27(1)：97-100.

［12］王曉丹，李慧慶.板藍(lán)根藥理作用研究進(jìn)展［J］.黑龍江醫(yī)藥，2010，23(2)：241-243.

［13］李成義，楊苗苗，張櫻山，等.甘肅不同產(chǎn)地板藍(lán)根中多糖含量分析［J］.西部中醫(yī)藥，2015，28(2)：5-7.

［14］趙麗.板藍(lán)根藥理作用、臨床應(yīng)用及不良反應(yīng)［J］.河北中醫(yī)，2010，32(7)：1059-1060.

［15］彭愛紅.板藍(lán)根藥理活性成分及臨床應(yīng)用進(jìn)展［J］.中國當(dāng)代醫(yī)藥，2010，17(12)：13-14.

［16］梁永紅，侯華新.板藍(lán)根二酮B體外抗癌活性研究［J］.中草藥，2000，31(7)：531-533.

［17］鄭劍玲，王美惠，楊秀珍.大青葉和板藍(lán)根提取物的抑菌作用研究［J］.中國微生態(tài)學(xué)雜志，2003，15(1)：18-19.

［18］夏新中，肖靜，石國芳，等.板藍(lán)根多糖對宿主抵抗鼠傷寒沙門菌感染能力的影響［J］.武漢大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2007，28(3)：348-350.

［19］張紅英，趙現(xiàn)敏，崔保安，等.板藍(lán)根多糖對豬繁殖與呼吸綜合征疫苗免疫豬T細(xì)胞亞群的影響［J］.中國免疫學(xué)雜志，2007，23(2)：134-137.

Effect of Isatis Root Polysaccharide in C57 Mice with Anti Tuberculosis Infection

XIANG Tian1,LIU Gao1,YANG Jin2
1 The Central Hospital of Enshi Autonomous Prefecture,Enshi 445000,China; 2 College of Traditional Chinese Medicine,Hubei Institute for Nationalities

A

1004-6852(2016)11-0007-04

2015-12-22

2011年湖北省自然科學(xué)基金計(jì)劃項(xiàng)目 (編號2011CDC018)。

向田(1981—)，女，在讀博士研究生，主管技師。研究方向：分子及感染免疫。