HPLC法同時測定環孢素A和其衍生物的含量

薛　彬，張　晴，鄭占偉，祝仕清，孟雅娟

(華北制藥集團新藥研究開發有限責任公司 微生物藥物國家工程研究中心

河北省工業微生物代謝工程技術研究中心，河北 石家莊 050015)

?

HPLC法同時測定環孢素A和其衍生物的含量

薛彬，張晴，鄭占偉，祝仕清，孟雅娟

(華北制藥集團新藥研究開發有限責任公司 微生物藥物國家工程研究中心

河北省工業微生物代謝工程技術研究中心，河北 石家莊 050015)

摘要：采用Diamonsil-C(18)色譜柱，柱溫60 ℃下，以磷酸水-乙腈為流動相，流速1.0 mL·min(-1),檢測波長210 nm，建立了同時測定發酵液中環孢素A和其衍生物的高效液相色譜(HPLC)檢測方法。結果表明，在10～2 000 μg·mL(-1)濃度范圍內，環孢素A和其衍生物的峰面積與濃度呈良好的線性關系，相關系數分別為1.0000和0.9999；按標準加入法計算回收率,環孢素A和其衍生物平均回收率分別為100.07%和100.06%；精密度實驗的RSD值分別為0.97%和1.14%。該方法具有分析時間短、操作簡便、結果準確、重現性好等特點。

關鍵詞：環孢素A；環孢素A衍生物；液相色譜法；發酵液

環孢素A是一種環狀的具有親脂性的含8個氨基酸的多肽化合物，主要由雪白白僵菌、茄病鐮刀菌和柱孢霉菌等霉菌經發酵得到[1]，被廣泛用于治療器官移植術后的排異反應、免疫系統特別是自身免疫系統疾病。近年來，也被用來治療再生不良性貧血癥和各類皮膚病[2]，并發揮了重大作用。隨著研究的不斷深入，人們發現在環孢素A發酵過程中有時會伴有環孢素A衍生物的產生，而這種衍生物經過一系列修飾后能夠成為一種具有抑制HCV活性的抗病毒藥物，同樣具有極大的研究價值[3]。此外，由于環孢素A發酵液成分復雜，除了環孢素A和其衍生物外，還會伴有很多其它復雜成分存在，且樣品數量多，因此，使用《中國藥典》和其它文獻方法[4-5]不能很好地對環孢素A、環孢素A衍生物和其它雜質進行分離，且分析時間較長。而高效液相色譜法(HPLC)對發酵液進行含量測定時能對各種成分很好地分離，且操作簡便快捷。作者在此建立了一種能夠同時測定環孢素A和其衍生物含量的HPLC法，擬為環孢素A和其衍生物的含量測定提供參考。

1實驗

1．1試劑與儀器

環孢素A對照品(含量98.8%，批號：080523)、環孢素A衍生物對照品(含量98.3%，批號：081017)，自制。

乙腈，色譜純，Honeywell公司；磷酸，分析純，天津永大化學試劑有限公司；水為二次蒸餾水。

LC-2010A型高效液相色譜系統、SPD-MZOA型二級管陣列檢測器，日本島津公司；Heraeuspico21型離心機，Thermo公司；CP225D型電子天平(十萬分之一)，Sartorius公司。

1．2方法

1．2.1色譜條件

采用二級管陣列檢測器掃描環孢素A和其衍生物的紫外光譜，發現在210nm處環孢素A和其衍生物均有較大吸收，故檢測波長選取210nm。實驗表明，WatersSymmetry-C18色譜柱和Diamonsil-C18色譜柱均能對環孢素A、環孢素A衍生物和其它雜質進行很好的分離，綜合考慮成本因素，選用Diamonsil-C18色譜柱。

Diamonsil-C18色譜柱(150mm×4.6mm，5μm)；

流動相：0.5‰磷酸水-乙腈(20∶80)；流速：1.0mL·min-1；檢測波長：210nm；柱溫：60 ℃；進樣量：10μL。

在上述色譜條件下，環孢素A和其衍生物能夠很好地分離，且雜質不干擾測定。

1．2.2溶液的配制

對照品溶液：稱取環孢素A和其衍生物對照品各10mg，置于同一100mL容量瓶中，用無水乙醇溶解并定容，搖勻，作為對照品溶液。

供試品溶液：取環孢素A發酵液原液，用無水乙醇稀釋4倍，3 000r·min-1下離心20min，取上清液作為供試品溶液。

1．2.3樣品含量的測定

分別取3批發酵液樣品(批號分別為：0627、0628和0629)，按1.2.2方法配制成3批供試品溶液，并取對照品溶液1份，按1.2.1的色譜條件進行分析，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算供試品中環孢素A和其衍生物的含量。

2結果與討論

2.1環孢素A和其衍生物對照品、環孢素A發酵液的HPLC圖譜(圖1)

圖1　環孢素A和其衍生物對照品(a)、環孢素A發酵液(b)的HPLC圖譜

2．2供試品的檢測結果(表1)

表1

供試品的檢測結果/(μg·mL-1)

Tab.1

Test results of samples/(μg·mL-1)

2.3線性關系考察

將環孢素A和其衍生物對照品分別配制成濃度(μg·mL-1)為2 000、1 000、300、200、100、50、10的溶液，按1.2.1的色譜條件進行分析，測定峰面積，以峰面積(y)為縱坐標，濃度(x)為橫坐標，分別繪制標準曲線，并擬合得回歸方程為：環孢素A：y=10 623x+803.68，R2=1.0000；環孢素A衍生物：y=11 740x+2 581.4，R2=0.9999。表明，在10～2 000 μg·mL-1濃度范圍內，環孢素A和其衍生物的峰面積與濃度呈良好的線性關系。

2.4回收率實驗

取12份已知濃度的供試品，其中6份精密加入環孢素A濃度為101.4 μg·mL-1的對照品溶液1 mL，另外6份精密加入環孢素A衍生物濃度為108.7μg·mL-1的對照品溶液1 mL，分別混勻后按1.2.1的色譜條件進行分析，計算回收率，結果見表2、表3。

表2

環孢素A回收率實驗結果

Tab.2

Recovery test results of cyclosporine A

表3

環孢素A衍生物回收率實驗結果

Tab.3

Recovery test results of cyclosporine A derivatives

由表2、表3可知，環孢素A和其衍生物平均回收率分別為100.07%和100.06%。

2.5穩定性實驗

取1份供試品溶液，在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h分別進樣，測得環孢素A和其衍生物峰面積RSD分別為1.92%和1.87%。表明環孢素A發酵液在24 h內穩定性好。

2.6精密度實驗

取環孢素A和其衍生物對照品分別配制成濃度約為100 μg·mL-1的溶液，再分別按1.2.1的色譜條件平行測定6次，測得環孢素A對照品峰面積的RSD為0.97%，環孢素A衍生物對照品峰面積的RSD為1.14%。表明方法的精密度較高。

2.7重復性實驗

取同一批供試品(批號：0627)6份，按1.2.1的色譜條件分析，測得環孢素A和其衍生物平均含量分別為142.3 μg·mL-1和100.8 μg·mL-1，RSD分別為1.21%和1.02%。表明方法的重復性良好。

3結論

采用Diamonsil-C18色譜柱，柱溫60 ℃下，以磷酸水-乙腈為流動相，流速1.0 mL·min-1，檢測波長210 nm，建立了同時測定發酵液中環孢素A和環孢素A衍生物的HPLC法。結果表明，在10～2 000 μg·mL-1濃度范圍內，環孢素A和其衍生物的峰面積與濃度呈良好的線性關系，相關系數分別為1.0000和0.9999；按標準加入法計算回收率，環孢素A和其衍生物平均回收率分別為100.07%和100.06%；精密度實驗的RSD值分別為0.97%和1.14%。該方法具有分析時間短、操作簡便、結果準確、重現性好等特點，特別適用于對環孢素A菌種的大量篩選。

參考文獻：

[1]鄭孝賢,邱觀榮,唐信東,等.環孢菌素A高產菌株搖瓶發酵及菌絲體的形態變化[J].中國抗生素雜志,2009,34(2):97-99.

[2]郭平,李芚,廖工鐵.環孢菌素臨床藥代動力學研究進展[J].中國藥學雜志,1995,30(10):585-588.

[3]任鳳芝,張雪霞,陳書紅,等.環孢素衍生物(γ-hydroxylmethylleucine4)-cyclosporin A的分離純化與鑒定[J].中國抗生素雜志,2013,38(7):512-515.

[4]耿艷輝,劉素彥,王素卿,等.高效液相色譜法測定環孢素A含量[J].理化檢驗：化學分冊,2013,49(4):408-410.

[5]廖蕓,沈友軒.高效液相色譜法測定環孢素A血藥濃度[J].江西醫學院學報,2009,49(5):54-58.

Simultaneous Determination of Cyclosporine A and Its Derivatives by HPLC

XUE Bin,ZHANG Qing,ZHENG Zhan-wei，ZHU Shi-qing，MENG Ya-juan

(HebeiIndustryMicrobialMetabolicEngineering&TechnologyResearchCenter,NationalEngineeringResearchCenterofMicrobialMedicine,NCPCNewDrugR&DCo.,Ltd.,Shijiazhuang050015,China)

Abstract：A simultaneous determination method of cyclosporine A and its derivatives in fermentation broth by HPLC was developed using Diamonsil-C(18) column at temperature of 60 ℃,phosphoric acid solution-acetonitrile as mobile phase with a flow rate of 1.0 mL·min(-1),and the detection wavelength of 210 nm.Results showed that,there was a good linear relationship between peak areas of cyclosporine A and its derivatives in the concentrations range of 10～2 000 μg·mL(-1),and the correlation coefficients were 1.0000 and 0.9999,respectively.The average recoveries for cyclosporine A and its derivatives were 100.07% and 100.06%，respectively,which were calculated by a standard addition method.The RSD values of precision experiment were 0.97% and 1.14%,respectively.This method is time-saving,convenient,accurate and reproducible.

Keywords：cyclosporine A;cyclosporine A derivatives;HPLC;fermentation broth

中圖分類號：O 657.72

文獻標識碼：A

文章編號：1672-5425(2016)03-0068-03

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.03.018

作者簡介：薛彬(1978-)，女，河北承德人，工程師，主要從事藥物研發工作，E-mail：binbin197809@163.com；通訊作者：孟雅娟，高級工程師，E-mail：mengyajuan@163.com。

收稿日期：2015-11-25