桑葚多糖的提取研究

馬明蘭，劉　陽，蔡麗娜，張　琳，譚珺雋

(武昌理工學院 湖北省生物多肽糖尿病藥物工程技術研究中心，湖北 武漢 430223)

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桑葚多糖的提取研究

馬明蘭，劉陽，蔡麗娜，張琳，譚珺雋

(武昌理工學院 湖北省生物多肽糖尿病藥物工程技術研究中心，湖北 武漢 430223)

摘要：采用沸水浸提法提取桑葚多糖，用醇沉法析出粗多糖后利用5%三氯醋酸脫蛋白純化得精制桑葚多糖。通過正交實驗確定最佳提取工藝條件為：料液比1∶6(mg∶mL)，浸提時間0.5 h，乙醇濃度90%，優化的5%三氯醋酸脫蛋白液料比為875∶1(mL∶g)。在最佳提取工藝條件下進行20倍放大實驗，精制桑葚多糖提取率可達2.63%。采用苯酚-硫酸法對桑葚多糖含量進行測定，以葡萄糖溶液為對照品溶液，在490 nm處測得吸光度與濃度線性關系良好(R=0.9997)；測定溶液在3 h內穩定性良好(RSD=1.02%)，重復性良好(RSD=1.22%)，回收率平均值為99.67%(RSD=0.93%)。該測定方法線性、精密度、準確度均滿足測定要求，并且方法簡單、成本低，值得廣泛應用。

關鍵詞：桑葚多糖；提取；醇沉法；苯酚-硫酸法；含量測定

桑葚是一種具有較高營養與藥用價值的食品，也是我國傳統的中草藥，具有滋陰補血、抗氧化、生津、潤腸、降血糖和降血壓的功效[1]，主要含有桑葚多糖、蘆丁、白黎蘆醇、蘜酸、原花色素、維生素和揮發油[2]。現代藥理學認為，桑葚多糖具有降血糖、抗氧化等多種潛在的藥用價值。從桑葚中提取多糖并將其制成經濟效益高的降糖藥物或保健品，能充分發揮我國豐富的桑葚等藥用植物資源優勢，造福大眾健康。作者采用沸水浸提法提取桑葚多糖，并優化了提取工藝條件。

1實驗

1.1材料、試劑與儀器

桑葚，購于湖北中醫藥大學醫藥店。

葡萄糖對照品，中國藥品生物制品檢定所；石油醚、95%乙醇、無水乙醇、無水乙醚、無水丙酮、三氯醋酸、濃硫酸、苯酚，均為國產分析純。

UV-1800型紫外可見分光光度計，日本島津；BT224S型電子分析天平，北京賽多利斯儀器系統有限公司；超聲波細胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器、RE-201C型旋轉蒸發儀，鞏義予華儀器有限責任公司；J-26XP型高速冷凍離心機，貝克曼庫爾特商貿中國有限公司。

1.2方法

1.2.1多糖的提取

桑葚→除雜質→烘干→搗碎→稱量→石油醚脫脂1h→冷卻抽濾→沸水浸提→旋轉濃縮→醇沉過夜→抽濾→粗多糖。

在單因素實驗的基礎上，選擇對多糖提取率影響較大的料液比(A)、浸提時間(B)、乙醇濃度(C)為考察因素，以桑葚多糖提取率為考核指標，進行正交實驗優化提取工藝，正交實驗的因素與水平見表1。

表1

正交實驗的因素與水平

Tab.1

The factors and levels of orthogonal experiment

1.2.2多糖的精制

將粗多糖分別用無水乙醇、無水乙醚、無水丙酮洗滌3次，然后加入一定量的5%三氯醋酸除去蛋白，離心，取上清液，再濃縮，加入乙醇使其含量達到80%，放入冰箱靜置12 h，離心，干燥，得精制桑葚多糖，測定多糖含量。

1.2.3桑葚多糖含量的測定

1.2.3.1標準曲線的繪制

精密稱取葡萄糖對照品10.03 mg置于100 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，得濃度為0.1003 mg·mL-1的葡萄糖對照品溶液，分別取0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL葡萄糖對照品溶液，分別加蒸餾水2.0 mL、1.8 mL、1.7 mL、1.6 mL、1.5 mL、1.4 mL，搖勻，再分別精密加入剛配制的5%苯酚溶液1 mL，搖勻，分別緩慢滴加濃硫酸5 mL，邊滴加邊振蕩，然后在40 ℃水浴中加熱30 min，冷卻，以空白試劑作參比，在400～550 nm波長范圍內掃描，以最大吸收峰處波長(490 nm)作為測試波長，測定吸光度(A)，繪制A-c標準曲線。

1.2.3.2桑葚多糖含量的測定

精密稱取桑葚多糖0.1 g，加100 mL水溶解，再稀釋20倍，按照苯酚-硫酸法測定吸光度，以空白試劑作參比，在490 nm處測定A。根據標準曲線計算桑葚多糖濃度，進而計算桑葚多糖提取率[3]。

1.2.4方法學評價

1.2.4.1穩定性

精密量取一定量的桑葚多糖溶液，按照與標準曲線相同操作，分別在490 nm處間隔0 min、30 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min測定A，計算RSD。

1.2.4.2精密度

精密量取6份等體積的桑葚多糖溶液，按照與標準曲線相同操作，測定A，計算RSD。

1.2.4.3準確度

精密稱取桑葚多糖0.025 g和葡萄糖對照品0.050 g、桑葚多糖0.050 g和葡萄糖對照品0.050 g、桑葚多糖0.075 g和葡萄糖對照品0.050 g各3份，混勻，按照1.2.3.2的方法配制樣品待測液，混勻，按照標準曲線相同操作，分別測定A，計算回收率。

2結果與討論

2.1正交實驗結果(表2)

表2

正交實驗結果與分析

Tab.2The results and analysis of orthogonal experiment

實驗號ABC多糖提取率/%1#1113.172#1221.893#1331.384#2124.215#2232.916#2313.957#3133.588#3211.959#3323.25k12.1453.6533.006k23.6892.2323.116k32.9112.8602.623R1.5441.4210.493

由表2可知，各因素對多糖提取率影響大小順序為：料液比>浸提時間>乙醇濃度，最佳提取工藝條件為A2B1C2，即料液比1∶6(mg∶mL)、浸提時間0.5 h、乙醇濃度90%。在最佳提取工藝條件下，重復實驗2次，多糖提取率分別為4.16%、4.30%，與正交表中4#實驗提取率4.21%比較，平均值為4.22%，RSD值為1.68%，說明提取工藝穩定。

將該工藝放大20倍，取干桑葚200 g實驗，多糖提取率為4.63%。和小試數據相比，放大實驗提取率相對較高，這可能是因為放大后，稱量及實驗誤差降低，這不影響最佳工藝路線的選擇。

2.2精制實驗結果

取放大實驗得到的桑葚多糖粗品進行精制實驗，測定桑葚多糖含量，結果見表3。

由表3可知，5%三氯醋酸量為取樣量的875倍時，去蛋白效果最佳，桑葚多糖含量最高，為72.02%。依照該方案對放大實驗剩余樣品進行去蛋白操作，最終制得桑葚多糖含量為73.18%，與上述實驗數據基本吻合，因此確定該工藝為去蛋白最佳工藝。

2.3多糖含量測定結果

按照1.2.3的測定方法，測定并繪制葡萄糖標準曲線，見圖1。

擬合線性回歸方程為y=0.0079x+0.0692(R=0.9997)，說明葡萄糖濃度在20.06～60.18 μg·mL-1范圍內與吸光度線性關系良好，可用于桑葚多糖含量的測定。

表3

去蛋白實驗結果

Tab.3

The results of deproteinization

圖1葡萄糖的標準曲線

Fig.1The standard curve of glucose

精制各次所得桑葚多糖粗品，測定其桑葚多糖含量，計算桑葚多糖提取率，結果見表4。

表4

多糖含量和提取率的測定結果/%

Tab.4

The results of content and extraction rate of polysaccharide/%

注：1#～9#是正交實驗編號，平行1、2為最佳條件下的實驗。

2.4方法學評價結果

2.4.1穩定性(表5)

由表5可知，180 min內測定7次的吸光度的平均值為0.388，RSD為1.02%，表明穩定性良好。

2.4.2重復性(表6)

由表6可知，6次測定的多糖含量平均值為35.68%，RSD為1.22%，表明重復性良好。

2.4.3準確度(表7)

由表7可知，方法的回收率平均值為99.67%，RSD為0.93%，表明該方法的準確度良好。

表5

溶液穩定性實驗結果

Tab.5

The results of solution stability experiment

表6

重復性實驗結果

Tab.6

The results of repeated experiment

3結論

采用沸水浸提法提取桑葚多糖，確定優化的工藝條件為：料液比1∶6(mg∶mL)，浸提時間0.5 h，乙醇濃度90%，5%三氯醋酸去蛋白最佳液料比為875∶1(mL∶g)。在最佳提取工藝條件下進行20倍放大實驗，并對所得桑葚多糖進行精制，多糖提取率可達2.63%。

采用苯酚-硫酸法進行桑葚多糖含量測定，以葡萄糖溶液為對照品溶液，在490 nm處測得吸光度與濃度線性關系良好(R=0.9997)；測定溶液在3 h內穩定性良好(RSD=1.02%)，重復性良好(RSD=1.22%)，回收率平均值為99.67%(RSD=0.93%)。該測定方法線性、精密度、準確度均滿足測定要求，并且方法簡單、成本低，值得廣泛應用。

表7回收率實驗結果

Tab.7

The results of recovery experiment

參考文獻：

[1]王強，王睿，王存，等.桑葚多糖調節血糖代謝及體外抗氧化效果研究[J].食品科學，2014，35(11)：260-264.

[2]劉玉玲，紀國力.桑葚中多糖的提取及含量的測定[J].中國醫藥科學，2012，2(18)：109-110.

[3]鄭曉艷，林藝華.中藥多糖的提取、分離純化及其含量測定方法概述[J].福建分析測試，2013，22(4)：58-62.

Extraction and Content Determination of Mulberry Polysaccharide

MA Ming-lan,LIU Yang,CAI Li-na,ZHANG Lin,TAN Jun-jun

(EngineeringTechnologyResearchCenterofBiologicalPeptideAntidiabeticsofHubeiProvince,WuchangUniversityofTechnology,Wuhan430223，China)

Abstract：Mulberry polysaccharide was extracted by hot water extraction,crude polysaccharide was obtained by alcohol precipitation method,and protein was further removed by 5% trichloroacetic acid to prepare purified mulberry polysaccharide.Through an orthogonal experiment,the optimal conditions of extraction were as follows:solid-liquid ratio of 1∶6(mg∶mL),extraction time of 0.5 h,ethanol concentration of 90%,and 5% trichloroacetic acid with liquid-solid ratio of 875∶1(mL∶g) to deprotein.For 20 times scale-up experiment,the extraction rate of purified polysaccharide could reach 2.63%.Mulberry polysaccharide content was determined by a phenol-sulfuric acid method.Using glucose solution as the reference substance solution,there was a good linear relationship(R=0.9997) between the absorbance at 490 nm and the concentration,the solution had good stability within 3 h(RSD=1.02%),It had good repeatability(RSD=1.22%),and the average recovery rate was 99.67%(RSD=0.93%).This method meets the requirements of linearity,precision and caauracy,and the method is simple,low-cost and with wide applications.

Keywords：mulberry polysaccharide;extraction;alcohol precipitation method;phenol-sulfuric acid method;content determination

基金項目：湖南省環保廳資助項目(湘財建指[2014]287號)，湖南農業大學東方科技學院大學生研究性學習和創新性實驗計劃項目(DFCXY201308)

中圖分類號：R 284.2

文獻標識碼：A

文章編號：1672-5425(2016)03-0039-04

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.03.011

作者簡介：馬明蘭(1982-)，女，湖北宜昌人，實驗師，研究方向：化學合成，E-mail：yuebianxing82@163.com。

收稿日期：2015-10-30