一致性檢驗比較兩種弓形蟲抗體檢測試劑盒

李知新，劉光遠，趙　燕，田進梅，張學軍，張和平，吳　潤（.甘肅農業大學動物醫學院，甘肅蘭州70070 2.中國農業科學院蘭州獸醫研究所家畜疫病病原生物學國家重點實驗室甘肅省動物寄生蟲病重點實驗室農業部草食動物疫病重點開放實驗室，甘肅蘭州70046；.寧夏動物疾病預防控制中心，寧夏銀川7500；）

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一致性檢驗比較兩種弓形蟲抗體檢測試劑盒

李知新1,2,3，劉光遠2*，趙燕3，田進梅3，張學軍3，張和平3，吳潤1
（1.甘肅農業大學動物醫學院，甘肅蘭州730070 2.中國農業科學院蘭州獸醫研究所家畜疫病病原生物學國家重點實驗室甘肅省動物寄生蟲病重點實驗室農業部草食動物疫病重點開放實驗室，甘肅蘭州730046；3.寧夏動物疾病預防控制中心，寧夏銀川750011；）

摘要：比較兩個弓形蟲抗體檢測試劑盒檢測結果的一致性，為流行病學調查和臨床診斷篩選可合理使用的商品化試劑盒。對510份豬血清分別進行弓形蟲抗體IHA和ELISA檢測，應用Kappa檢驗比較兩種試劑盒檢測結果的一致性并進行分析，用x2檢驗分析差異性。兩種試劑盒聯合檢出79份陽性，陽性符合率為67.52％，陰性符合率為95.17％，總符合率為88.82％。x2檢驗差異顯著（x2=228.23，p=0.00）；u檢驗值為15.89，兩種產品的一致性為中度一致（Kappa值=0.66）。所以弓形蟲病IHA檢測試劑盒可作為現場收益流行病學調查，而弓形蟲IgG抗體ELISA檢測試劑盒適合輔助臨床檢測和診斷。x2檢驗比較兩種試劑盒具有局限性。u檢驗排除偶然性造成的一致程度，與Kappa檢驗結合可比較一致性。弓形蟲抗體檢測要根據實況選擇不同的試劑盒。

關鍵詞：弓形蟲；Kappa檢驗；x2檢驗；u檢驗；IHA；ELISA

弓形蟲（Toxoplasma）是一種細胞內專性寄生原蟲，可引起人獸共患寄生蟲病[1]。弓形蟲病缺乏特異性臨床癥狀和體征，臨床癥狀表現復雜多變，診斷較為困難，對其有效地診斷顯得尤為重要[2]。弓形蟲病檢測以免疫學為主，如間接血凝試驗（IHA）、酶聯免疫吸附試驗（ELISA）、間接熒光抗體試驗（IFA）、膠乳凝集試驗（LA）等[3]。目前市售商品化試劑盒種類較多，基層實驗室常用IHA和ELISA方法診斷弓形蟲病。

Kappa一致性檢驗在診斷試驗中有兩種情況中：一種是評價待評價的診斷實驗方法與金標準的一致性；另一種是評價兩種診斷方法對同一個樣本的診斷結果的一致性或兩個檢驗工作者對同一種現象的診斷結論的一致性或同一檢驗工作者對同一現象前后進行兩次觀察做出的診斷的一致性[4-6]。應用Kappa檢驗比較獸醫檢測試劑盒國外曾有報道。如Willems T等人利用兩種商品化的試劑盒，對口蹄疫病毒細胞增值活性進行檢測，細胞增殖檢測試劑盒和細胞活性檢測試劑盒具有極強的一致性（u值=0.85，Kappa值=0.97）[7]；Chen T H等人用Kappa檢驗比較了口蹄疫病毒液相芯片檢測法和3ABC多肽阻斷ELISA檢測法，兩種檢測方法的符合率為96.3％，Kappa檢驗強度極強（Kappa值=0.92）[8]。國內除劉華用Kappa檢驗比較豬藍耳病ELISA抗體檢測試劑盒外[9]，未見其他報道。本試驗用兩個商品化的弓形蟲檢測試劑盒開展弓形蟲抗體檢測，并對檢測結果進行了一致性檢驗和分析，為選擇獸醫診斷試劑提供科學依據。

1　材料與方法

1.1試劑

弓形體間接紅細胞凝集試驗試劑盒購自中國農業科學院蘭州獸醫研究所（抗原和標準陽性血清批號：20131030，標準陰性血清和稀釋液批號：20130815），動物弓形蟲IgG抗體ELISA檢測試劑盒購自海泰生物制藥有限公司（批號：20131106）。

1.2豬血清

510份豬血清采自寧夏16個規模化養殖場和61個散養戶。

1.3方法

1.3.1檢測方法

1.3.1.1弓形蟲間接血凝試驗按試劑盒說明書進行操作。結果判定時，陽性對照血清滴度不低于1∶1024；陰性對照血清除第1孔允許存在前滯現象“+”外，各孔均為“-”；稀釋液對照為“-”實驗成立。被檢血清抗體滴度≥1∶64，“++”判為陽性。

1.3.1.2弓形蟲IgG抗體ELISA檢測將樣品和樣品稀釋液按1:100比例稀釋。按照試劑盒說明書進行操作。結果判定時，陰性對照OD450nm≤0.20，臨界對照0.2＜0OD450nm＜0.60、陽性對照OD450nm＞0.60時，試驗成立。被檢樣品OD450nm＞臨界對照OD450nm×1.1判為陽性；被檢樣品OD450nm＜臨界對照OD450nm×0.9判為陰性；介于二者之間判為可疑，需重新測定。

1.3.2Kappa系數的計算制作C×C列聯表，按照參考文獻[4-6]方法計算Kappa值。

1.4統計學方法和參考判斷指標

采用SPSS20.0統計學軟件對2種產品檢測的陽性率進行x2檢驗；u檢驗按照參考文獻[4]計算，用來排除抽樣誤差的影響，在α=0.05的檢驗水準下＜0.05在統計學上認為Kappa值并非由抽樣誤差所致，如果u值＜1.96，則＞0.05，則Kappa值大小沒有意義。一致性檢驗進行Kappa分析，當K＜0，極差；0.0～0.2，微弱；0.21～0.40，弱；0.41～0.60，中度；0.61～0.80，高度；0.81～1.00，極強[10]。

2　結果

IHA試劑盒單獨檢出98份陽性，陽性率19.22％ （98/510），IgG抗體ELISA試劑盒單獨檢出117份陽性，陽性率22.94％（117/510），IgG抗體ELISA試劑盒檢測陽性略高于IHA試劑盒，經x2檢驗差異顯著（x2=228.232，p=0.00）。

兩種試劑盒聯合檢出79份陽性，陽性率符合率為67.52％（79/117），陰性符合率為95.17％（374/393），總符合率為88.82％（453/510）。為排除因抽樣誤差等偶然性導致兩種結果的一致性，進行u檢驗，經檢測u檢驗值為15.89，大于95％標準正態分位數1.96，Kappa一致性檢驗值為0.66，表明兩種產品的一致性強度為中度。兩種試劑盒同時檢測510份血清結果見表1。

3　討論

Kappa一致性檢驗在醫學、農業等眾多領域中應用較為廣泛[6,9-12]。在檢驗醫學研究工作中，常遇到兩種檢測方法或兩名檢驗人員的檢測結果是否一致以及用同一種方法進行多次測定的結果能否重現的問題[6]。國內在獸用疫病檢測試劑盒、實驗室比對等方面應用一致性檢驗的方法對檢驗結果進行分析報道不常見。

有關文獻中常見用符合率、x2檢驗、t檢驗和回歸系數等方法間接反映兩種結果的一致性，這些統計方法都存在局限性和不足[5]。在比較試劑盒之間的一致性時，x2檢驗只能分辯兩者差異有無統計學意義，不能反映兩者是否一致，甚至可能得出完全相反的結論，這與王潔貞等人的觀點一致[4]。而Kappa檢驗不僅可用于一致性檢驗，而且能給出一個反映一致性程度的值[5]。根據實際資料計算的K值只是一個樣本的統計量，存在著抽樣誤差，因而，所計算的K值是否來自K值為“0”的總體（即兩者之間的一致程度是由于機遇造成的），應當經過假設檢驗（u檢驗）[6]。本試驗u檢驗值為15.89，大于95％標準正態分位數1.96，故P＜0.05，可以排除偶然性導致的兩種結果的一致，在α=0.05的檢驗水準下可認定兩種檢驗方法具有一致性，且根據Kappa值為0.66這個判斷指標，表明兩種產品的一致性強度為中度，說明這兩種試劑盒在血清學調查中差異不顯著，而x2檢驗表明兩種試劑盒檢測差異顯著。

弓形蟲蟲體蛋白質基因組復雜，在宿主體內產生的抗體也就不同。雖然重組抗原診斷弓形蟲病的特異性很高，但敏感性仍低于天然抗原，將多個重組抗原組合成“雞尾酒”式的診斷抗原或重組復合多表位診斷抗原等方法有望克服漏檢現象，提高診斷的準確性[3]。但是弓形蟲病的IHA一般在病后1個月左右出現陽性[13，15]，因此，除人為因素外，與陽性出現的早晚有很大關系，而且IHA操作簡便，不需要特殊檢測儀器，因此認為該方法更適用于現場流行病學調查，這與李冕、Patton S等人的觀點一致[2,13]。周海寧等人認為弓形蟲間接血凝方法陽性檢出率低，結果判定與人為因素影響大有關，而弓形蟲IgG抗體ELISA方法客觀、敏感，省時、快捷，更適合于血清學調查[14]。由于該方法可出現假陽性，建議應用于輔助臨床檢測和診斷，這與陳麗萍等人觀點一致[15]。因此，應根據現有診斷資源合理選擇弓形蟲病的診斷方法，以適應不同感染階段的診斷和不同目的的檢測。

表1　兩種試劑盒檢測結果比較

參考文獻:

[1]Sibley L D，Boothroyd J C.Virulent strains of Toxoplasma gondii comprise a single clonal lineage[J].Nature，1992，359（6390）：82-85．

[2]李冕，尹昆，閆歌.弓形蟲病的診斷技術及其研究進展[J].中國病原生物學雜志，2011，6（12）：942-944．

[3]盧志民，張進順.弓形蟲感染免疫診斷抗原研究進展[J].中國血吸蟲病防治雜志，2011，23（5）：590-594．

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[8]Chen T H,Lee F,Lin Y L,et al.Development of a Luminex assay for the detection of swine antibodies to non-structural proteins of foot-and-mouth disease virus[J].J Immunol Methods,2013,396(1-2):87-95.

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[14]周海寧，張成蓮，王進香，等.豬弓形蟲血清學檢測方法比較[J].中獸醫醫藥雜志，2014：38-39．

[15]陳麗萍，陳慰，桂馨.ELISA弓形蟲IgG抗體試劑盒的研制[J].放射免疫學雜志，2002，15（1）：57-59．

通訊作者：劉光遠*

作者簡介：李知新（1981-），男，寧夏隆德人，高級獸醫師，在讀獸醫博士，主要從事動物疾病預防與控制研究。

基金項目：寧夏回族自治區科技支撐項目（2013ZZN30）

中圖分類號：S855.9

文獻標識碼：B

文章編號：1006-799X(2016)12-0081-02