TCF25干擾慢病毒載體的構建與鑒定

李佑鋒++彭浩++高建芳等

摘 要 為構建一個針對TCF25（transcription factor 25）基因的慢病毒干擾載體， 設計并合成3組針對TCF25的短發(fā)夾RNA序列 （shRNA），通過基因重組技術連入 pLL3.7載體，酶切鑒定及DNA測序后，重組正確的pLL3.7質粒與病毒包裝質粒共轉染293FT細胞，培養(yǎng)48 h后，分別收集細胞培養(yǎng)上清液，感染H9C2細胞，Westernblot檢測TCF25在H9C2細胞中的表達.結果顯示TCF25蛋白在H9C2細胞中的表達被抑制.這說明TCF25的慢病毒干擾載體構建成功.

關鍵詞 TCF25基因；293FT細胞；H9C2 細胞；慢病毒載體

中圖分類號 Q786文獻標識碼 A文章編號 10002537（2016）02002306

Construction and Characterization of a Lentiviral Vector for RNA Interference of TCF25

LI Youfeng， PENG Hao， GAO Jianfang， GAO Jing， CHEN Yu， WU Xiushan， LI Yongqing*

（Center for Heart Department， Key lab of MOE for Department Biology and Protein Chemistry，

Hunan Normal University， Changsha 410005， China）

Abstract Objective To construct a lentiviral vector for RNA interference of TCF25 （transcription factor 25） gene and identify it. Methods Three pairs of complementary short hairpin RNA （shRNA） oligonucleotides targeting the TCF25 gene were designed， synthesized， and then inserted into pLL3.7 vectors by gene recombination technology. The recombinant plasmid was identified by enzyme digestion and DNA sequencing. Correct recombinant plasmids were cotransfected with packaging plasmids into 293FT cells. The cell culture supernatant was obtained after 48 hours， and then applied to infect H9C2 cells. The expression of TCF25 in H9C2 cells was detected by westernblot. Results The recombinant plasmid was successfully constructed. The westernblot showed that the expression of TCF25 in H9C2 cells was inhibited after the cells were successfully infected with the lentiviral vector supernatant. Conclusion The lentiviral vector interfering TCF25 was constructed successfully.

Key words TCF25 gene； 293FT cell； H9C2 cell； lentiviral vector

TCF25（transcription factor 25）是在小鼠胚胎發(fā)育過程中廣泛表達的一個含有bHLH結構域的轉錄因子，且其C端還含有一個功能未知的DUF654結構域.根據TCF25廣泛的表達模式和包含的轉錄激活結構域，推測其可能在腦和心臟等各種器官發(fā)育過程中發(fā)揮重要的調控作用[13].同時，已有研究表明TCF25作為SRF信號通路的抑制因子調控基因的表達，且能夠抑制P19CL6細胞向心肌細胞分化[4]，但其具體作用機制需要繼續(xù)探索.

RNA干擾（RNA interference，縮寫RNAi）是指在進化過程中高度保守的雙鏈RNA（doublestranded RNA，dsRNA）誘發(fā)的基因沉默現象，能夠特異性剔除或關閉靶基因的表達[5].目前，該技術已被廣泛用于探索基因功能和基因治療領域等[6].RNAi技術主要是將siRNA序列設計為一段shRNA（short hairpin RNA，短發(fā)夾RNA）克隆進質粒載體中，轉染細胞后被轉錄形成一個雙鏈RNA誘導基因沉默發(fā)生.慢病毒載體是根據HIV病毒基因特征，利用其基因結構重組構建而成.其能夠將外源目的基因或外源的shRNA高效地整合到宿主基因組上并持久表達[78].慢病毒載體能夠高效地感染心……