B7-H1在卵巢癌組織中表達的臨床意義

徐　梅　張　夢　劉　洋　張　蓓　尹鳳玲　劉　霞　卓世超

221009 江蘇省徐州市中心醫院

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B7-H1在卵巢癌組織中表達的臨床意義

徐梅張夢劉洋張蓓尹鳳玲劉霞卓世超

221009 江蘇省徐州市中心醫院

【摘要】目的探討B7-H1在卵巢癌組織中表達的臨床意義。方法將收治的112例上皮性卵巢癌及10例良性卵巢囊腫的組織蠟塊制作成組織芯片，免疫組化檢測芯片協同刺激分子B7-H1的表達情況，χ2檢驗B7-H1表達水平與患者臨床病理參數的關系。生存分析采用Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗及多因素 COX回歸。結果B7-H1在良性卵巢囊腫中均為低表達，在卵巢癌組織中高表達率為55.4%(62/112)；其表達水平與患者年齡、組織類型、細胞分化、腫瘤大小及是否合并CA125升高無關(P>0.05)，而與患者FIGO分期及是否轉移密切相關(P<0.05)；B7-H1高表達組與低表達組患者無進展生存期(progression-free survival，PFS)和總生存期(overall survival，OS)比較差異均有統計學意義(χ2值分別為24.9和17.51，P值均<0.001)。COX回歸分析表明，B7-H1表達水平和FIGO分期是影響患者生存的獨立預后因素。結論卵巢癌組織中B7-H1的表達水平與預后差和生存期短相關，可為卵巢癌的免疫靶向治療提供思路。

【關鍵詞】卵巢癌；協同刺激分子；B7-H1

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:380～383)

隨著腫瘤免疫學及現代生物科技的發展，腫瘤免疫治療已經取得突破性的進展。B7家族是T細胞活化的重要協同刺激分子，B7-H1也稱PD-L1(programmed death-1-ligand 1)，是該家族的第三個成員，該分子在誘導腫瘤特異性T細胞凋亡和腫瘤免疫逃逸過程中具有重要作用[1]。而B7-H1在卵巢癌中的作用目前研究尚少，值得探討。我們收集與卵巢癌相關的臨床資料，擬合多因素COX模型分析B7-H1分子表達對卵巢癌患者復發或死亡風險的影響，從而探討B7-H1在卵巢癌組織中表達的臨床意義，為卵巢癌的免疫靶向治療提供思路。

1材料與方法

1.1試劑

B7-H1鼠抗人多抗克隆抗體，USCNLIFE，USA，鼠/兔通用型二抗，購自福州邁新生物技術有限公司。

1.2病例資料

112例石蠟包埋組織標本取自2005年2月至2009年12月間在我院住院手術治療的卵巢癌患者。年齡21～78歲，平均(55.1±12.5)歲；其中漿液性囊腺癌93例、粘液性囊腺癌12例、子宮內膜樣腺癌3例、透明細胞癌4例；腫瘤大小1～4 000 cm3，平均(171.9±423.2)cm3；FIGO分期Ⅰ期26例、Ⅱ期7例、Ⅲ期72例、Ⅳ期7例；細胞分化Ⅰ級9例、Ⅱ級20例、Ⅲ級78例、交界性腫瘤5例；腫瘤位于雙側者65例，右側24例、左側23例；82例患者血CA125水平升高；腫瘤轉移85例。所有患者術前未接受化療或放療。手術標本取材時，癌組織均取自腫瘤原發灶。另取同期10例因良性卵巢囊腫手術切除的標本做正常對照。

所有患者均同時滿足下列條件：術后生存期≥3個月，死亡原因是卵巢癌而非其他疾病。通過查閱住院病例、電話或登門隨訪等方式對所有患者追蹤隨訪至2014年12月。

1.3免疫組織化學染色

由上海芯超公司將采集的所有蠟塊制作成組織芯片，然后進行Elivision TM 免疫組織化學染色。石蠟切片經脫蠟和水化后，將切片浸在檸檬酸鹽緩沖液中水浴加熱至100 ℃，持續30 min，進行抗原修復。然后將切片冷卻浸在3%H2O2中30 min。然后用PBS浸洗3次。再加一抗B7-H1鼠抗人多抗克隆抗體，1∶400稀釋，4 ℃過夜，用PBS代替一抗作為陰性對照。將切片在PBS中浸洗3次，然后加二抗，室溫放置30 min，用PBS洗去二抗，經DAB顯色，蘇木精復染，0.1%鹽酸酒精分化。切片經梯度酒精脫水干燥后用中性樹脂封片。

1.4免疫組化結果判讀

應用Immunohistochemical Scores(IHS)法對免疫組織化學染色切片進行評估。在200倍高倍鏡下，隨機選擇5個腫瘤區域，計數胞質/胞膜內有陽性染色的腫瘤細胞個數，根據其所占比例計分。無陽性細胞為0分，陽性細胞占1%～10%為1分，11%～50%為2分，51%～80%為分，81%～100%為4分；同時評估陽性細胞染色的強弱：陰性計0分，弱陽性計1分，中度陽性計2分，強陽性計3分。兩項得分的乘積即為該例病變的免疫組化評分：0為-，1～4分為+，5～8分為++，9～12分為+++。評分<4分為低表達，≥4分為高表達。

1.5統計學方法

計量資料以均數±標準差表示，所有數據均應用SPSS 17.0統計軟件包進行統計學處理，B7-H1高表達組及低表達組間比較采用χ2檢驗，生存分析采用Log-rank時序檢驗及Kaplan-Meier生存曲線法，對B7-H1表達、細胞分化程度、轉移與否及FIGO分期及年齡多因素分析采用COX模型分析。

2結果

免疫組織化學染色結果:B7-H1分子在10例正常卵巢囊腫中均呈低表達，在112例卵巢癌組織中高表達率為55.4%(62/112)。 且表達于腫瘤細胞的胞膜和(或)細胞質中，呈棕黃色至棕褐色顆粒或團塊。

B7-H1表達與患者年齡、組織學類型、組織分化程度、FIGO臨床分期、腫瘤大小、CA125水平及轉移與否的關系見表1。

表1　卵巢癌組織中B7-H1表達與其臨床病理參數的關系/例

Kaplan-Meier 法檢測B7-H1表達水平不同患者的PFS及OS曲線見圖1和圖2?；颊逷FS的計算起點為手術當日，終點為患者確診為腫瘤復發或病情惡化時。OS的計算起點為手術當日，終點為患者死亡日期或截止日期。隨訪截止日期為2014年12月31日。112例卵巢癌患者隨訪5年中，B7-H1低表達者復發率為46.0%(23/50)、死亡率為34.0%(17/50)；而高表達者復發率為82.3%(51/62)、死亡率為66.1%(41/62)；B7-H1高表達組與低表達組患者PFS[(1059.1±151.8)天 vs(2358.8±180.2)天]和OS[(1675.8±169.2)天vs(2654.1±149.4)天]比較，差異均有統計學意義(χ2值分別為24.9和17.51，P值均<0.001)。

COX回歸多因素分析結果： B7-H1表達情況(B=0.98，RR=2.66，P=0.002)和FIGO分期(B=0.78，RR=2.17，P=0.03)是影響患者生存的獨立預后因素。

圖1　B7-H1不同表達水平患者的PFS曲線圖

圖2　B7-H1不同表達水平患者的OS曲線圖

3討論

B7-H1也稱pD-L1(programmed death ligand-1)，是1999年發現的B7家族成員，B7-H1基因定位于人9p24.2[2]，編碼產物為一個含290個氨基酸的I型跨膜糖蛋白，B7-H1的受體為PD-1(CD279)，PD-1最初是通過削減雜交技術，從小鼠凋亡期的雜交瘤及造血祖細胞系克隆得到的。由于其和細胞凋亡相關故被命名為程序性死亡-1(programmed death-1,PD-1)。人類PD-1基因編碼含288個氨基酸的I型跨膜糖蛋白，其細胞外區為免疫球蛋白樣IgV區，細胞質區含有2個酪氨酸基序，N端有1個免疫受體酪氨酸依賴抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif，ITIM)，C端有1個免疫受體酪氨酸轉換基序(immunoreceptor tyrosine switch motif，ITSM)，這兩個酪氨酸殘基磷酸化后可分別與酪氨酸磷酸酶 SHP-1 和 SHP-2結合，下調 TCR 和 BCR 下游激活信號的磷酸化，轉導抑制性信號，發揮抑制免疫應答的作用[2-4]。這種表達特點可能與保護組織免受不必要的炎性反應或免疫反應有關。近些年的研究發現，在許多人類腫瘤組織(如胃癌[5-6]、食管癌[7]、胰腺癌[8]、肺癌[9]、卵巢癌[10]、膀胱癌[11]、腎細胞癌[12]、淋巴瘤[13]、乳腺癌[14]和白血病[15]等)中均可檢測到 B7-H1 蛋白的異常表達。

B7-H1在腫瘤組織中的表達水平和患者的臨床病理因素及預后存在顯著相關性。Ohigashi等[7]對食管癌患者腫瘤細胞B7-H1的表達水平與愈后相關性進行了分析，發現術前癌細胞B7-H1陽性患者明顯比B7-H1陰性患者愈后差，1年生存率明顯降低，且癌細胞的復發轉移發生率高。Wu等[5]對102例胃癌組織中B7-H1的表達情況和臨床病理學及預后相關性分析發現，B7-H1在正常胃組織中沒有表達，在胃腺瘤中微弱表達，但在42.2%胃癌組織中強表達。而且，其表達程度和腫瘤大小、浸潤深度、淋巴結轉移及患者的生存期相關。多因素分析顯示，B7-H1表達情況是評價胃癌患者預后的獨立因素。本研究檢測B7-H1在112例卵巢癌組織中的表達情況，并對患者進行5到10年的隨訪，結果顯示B7-H1陽性染色定位于腫瘤細胞的胞漿或(和)胞膜，在10例良性卵巢囊腫中B7-H1均為低表達，在卵巢癌中的B7-H1高表達率為55.4%，略高于于曉偉等[16]的研究結果。同時研究還發現，B7-H1的表達水平和細胞分化、腫瘤大小、是否合并CA125升高及患者年齡無明顯相關性，而和患者FIGO分期及是否轉移密切相關?；颊吲R床分期越晚或是并發轉移者，其B7-H1表達水平越高。這和Wang等[11]采用mate分析研究B7-H1在膀胱癌中表達水平得出的結論類似。Hamanishi等[10]發現在卵巢癌組織中B7-H1的表達水平和腫瘤組織中CD8+T的數量負相關，且多因素分析顯示，它們是患者的獨立預后因素。我們的研究顯示，B7-H1低表達者比高表達者有更長的PFS和OS，高表達相對低表達有更高的復發率(82% vs 46%)和死亡率(66.1% vs 34%)。說明卵巢癌細胞表達B7-H1與預后差和生存短有關。而COX回歸分析亦顯示，B7-H1表達水平和FIGO分期是EOC患者的獨立預后因素。

Sun等[6]成功構建兩種鼠抗人PD-L1單克隆抗體10E10 和2H11，它們可以抑制腫瘤相關PD-L1誘導的T細胞凋亡，通過共刺激分子調控網絡和免疫干預途徑進行腫瘤免疫治療具有重要價值。DC表達B7-H1本身即可限制DC處于未成熟狀態，與腫瘤細胞免疫逃逸及腫瘤進展相關[9]，通過沉默DC細胞B7-H1的表達，進而增強體內抗腫瘤免疫的實驗研究也獲得了肯定的結果[17]，這充分說明B7-H1可作為激活機體抗腫瘤免疫治療的很好靶點。目前，該療法已被應用于非小細胞肺癌的臨床試驗治療并取得一定的成效[18]。因此，通過分子生物學手段檢測和控制卵巢癌細胞表面B7-H1分子的表達，對于卵巢癌的治療和預防具有重要意義。

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(編輯：吳小紅)

Expression and Clinical Significance of B7-H1 in Ovarian Cancer

XUMei,ZHANGMeng,LIUYang,etal.

CentralHospitalofXuzhou,Xuzhou，221009

【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression and clinical significance of B7-H1 in ovarian cancer.Methods112 biopsies from patients with epithelial ovarian cancer(EOC) and 10 specimens from ovarian benign neoplasm were processed into tissue chips.The expression of B7-H1 were detected by immunohistochemical method and its relationship with patients' clinical parameter were tested by Pearson Chi-Square.Survival curves were constructed using the Kaplan-Meier method and the log-rank test.The independent prognostic factors were evaluated by using the Cox regression model.ResultsThe B7-H1 high expression rates were 0 in benign ovarian neoplasm tissues and 55.4%(62/112) in EOC tissues.The level of B7-H1 expression was positively correlated with clinical stage and distant metastases(P<0.05).No relationship was observed between the expression of B7-H1 and age,primary tumor size,primary tumor classification,histological grade and the level of blood CA125(P>0.05).The progression-free survival(PFS) and the overall survival(OS) were significantly lower in patients with B7-H1 high expression than in those with B7-H1 low expression.Multi-variable analysis revealed that the expression of B7-H1 and the clinical stage could be regarded as the independent factor in evaluating the prognosis of EOC patients.ConclusionThe level of B7-H1 expression in EOC tissues is significantly correlated with the poor prognosis and relapse rate.B7-H1 might be a beneficial target for immunotherapy in EOC patients.

【Key words】Ovarian neoplasrn;Co-stimulator;B7-H1

(收稿日期2015-04-30修回日期 2015-10-28)

中圖分類號：R737.31

文獻標識碼：A

文章編號：1001-5930(2016)03-0380-04

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.03.010

通訊作者：徐梅

基金項目：徐州市醫學科研資助項目(編號：XWJ2011038)，徐州市中心醫院博士創新團隊科研資助(編號：XZB201205)