沙利度胺對潰瘍性結腸炎大鼠MMP-9、COX-2、IL-6水平的影響

黃　鶴　倫偉健　梁曉燕　劉　瀏　賈柳萍

(佛山市南方醫科大學附屬南海醫院消化內科，廣東　佛山　528200)

?

沙利度胺對潰瘍性結腸炎大鼠MMP-9、COX-2、IL-6水平的影響

黃鶴倫偉健梁曉燕劉瀏賈柳萍

(佛山市南方醫科大學附屬南海醫院消化內科，廣東佛山528200)

〔摘要〕目的探討沙利度胺治療潰瘍性結腸炎(UC)大鼠的療效及對基質金屬蛋白酶(MMP)-9、環氧合酶(COX)-2、白介素(IL)-6水平的影響。方法利用隨機數字表法將60只雄性Wistar大鼠分為空白對照組、模型組、柳氮磺胺吡啶組和沙利度胺組，除空白對照組外，其余大鼠均應用2,4,6-三硝基苯磺酸與乙醇溶液混合液復制UC模型，空白對照組和模型組給予生理鹽水灌胃；柳氮磺胺吡啶組給予柳氮磺胺吡啶混懸液灌胃；沙利度胺組給予沙利度胺片混懸液灌胃，于第3、7、10、14天觀察結腸炎癥活動指數評分(DAI)以及免疫組化結果。結果藥物干預不同時間點，四組大鼠DAI評分、MMP-9、COX-2和IL-6水平的總體差異有統計學意義(P<0.05)。模型組、柳氮磺胺吡啶和沙利度胺組DAI評分、MMP-9、COX-2和IL-6水平均高于空白對照組(P<0.05)。模型組DAI評分、MMP-9、COX-2和IL-6水平較柳氮磺胺吡啶和沙利度胺組高，柳氮磺胺吡啶組MMP-9、COX-2和IL-6水平較沙利度胺組高(P<0.05)。結論沙利度胺治療UC大鼠能夠顯著降低其DAI水平和MMP-9、COX-2、IL-6的表達，且其治療效果優于柳氮磺胺吡啶，有待進一步研究和推廣。

〔關鍵詞〕潰瘍性結腸炎；沙利度胺；基質金屬蛋白酶9；環氧合酶-2；白介素-6

相關研究表明〔1〕，潰瘍性結腸炎(UC)的病理改變與細胞外基質(ECM)有關，而基質金屬蛋白酶(MMPs)在ECM的降解、組織的損傷和修復過程中發揮重要作用，MMPs裂解ECM成分通過改變內皮細胞的通透性參與黏膜損傷和修復。此外，多種細胞因子如環氧合酶(COX)-2、白介素(IL)-6等也參與UC的進展〔2〕。目前，UC的治療主要是針對發病機制的治療，包括阻斷炎癥反應、調節免疫功能等。相關研究表明〔3〕，沙利度胺具有免疫調節、抗感染、抗血管生成作用。本研究旨在探討沙利度胺治療UC大鼠的療效及對MMP-9、COX-2、IL-6水平的影響。

1材料與方法

1.1實驗動物健康清潔級雄性Wistar大鼠(山東魯抗醫藥公司實驗動物中心，質量合格證：SCXK(魯)2013 0001)60只，體重220~260 g。普通飼料喂養，飼養溫度18℃~20℃，相對濕度50%~60%，光照12 h/d。

1.2藥品和實驗試劑柳氮磺胺吡啶腸溶片(上海中西三維藥業有限公司，國藥準字H31020450)；沙利度胺片(常州制藥廠有限公司，國藥準字H32026130)。2,4,6-三硝基苯磺酸(美國Sigma公司)；牛血清蛋白(美國Sigma公司)；鏈霉親和素-生物素復合物(武漢博士德生物工程有限公司)；二氨基聯苯胺顯色試劑盒(德國Roche公司)。

1.3實驗方法

1.3.1動物分組利用隨機數字表法將60只雄性Wistar大鼠分為空白對照組、模型組、柳氮磺胺吡啶組和沙利度胺組，每組15只。空白對照組大鼠給予0.9%Nacl溶液灌腸，造模后放回鼠籠，蘇醒后繼續常規飼養。其余大鼠禁食不禁水48 h，經腹腔注入水合氯醛(10%，0.3 mg/100 g)，深度麻醉后將新生兒吸痰管(直徑6F)石蠟潤滑后，從肛門向內插入8 cm，將2,4,6-三硝基苯磺酸(100 mg/kg)與乙醇溶液(50%，0.3 ml)混合液由肛門注入，將大鼠尾部提起，倒置2~3 min，防止藥物流出。

1.3.2藥物干預空白對照組和模型組給予生理鹽水10 ml·kg-1·d-1灌胃；柳氮磺胺吡啶組給予柳氮磺胺吡啶混懸液100 ml·kg-1·d-1灌胃；沙利度胺組給予沙利度胺片混懸液200 ml·kg-1·d-1灌胃。1次/d，連續2 w。

1.3.3取材及標本處理給藥2 w后，處死大鼠，固定，經心臟取血，采用酶聯免疫吸附劑測定法(ELISA)測定MMP-9、COX-2和IL-6的水平。沿腹中線切開腹壁，分離結腸，截取距肛門2~10 cm部分結腸組織，沿腸系膜剪開腸腔，用4℃生理鹽水沖洗。

1.4觀察指標分別于藥物干預第3、7、10、14天時進行結腸炎癥活動指數評分(DAI)，依據DAI評分標準〔4〕，對大鼠體重下降百分比、大便性狀和血便情況進行統計，取均值作為最終得分，并檢測免疫組化結果(包括MMP-9、COX-2和IL-6水平)。

1.5統計學方法應用SPSS16.0軟件行方差分析、LSD法。

2結果

2.1各組大鼠DAI評分比較藥物干預不同時間點，四組大鼠DAI評分的總體差異有統計學意義(P<0.05)。藥物干預第3、7、10、14天模型組、柳氮磺胺吡啶和沙利度胺組大鼠DAI評分均高于空白對照組(P<0.05)。藥物干預第7、10、14天模型組大鼠DAI評分較柳氮磺胺吡啶和沙利度胺組高，且第14天時，沙利度胺組DAI評分顯著低于柳氮磺胺吡啶組(P<0.05)。見表1。

表1　不同組別大鼠DAI評分比較，分，n=15)

與對照組比較:1)P<0.05；與模型組比較:2)P<0.05；與柳氮磺胺吡啶組比較：3)P<0.05；下表同

2.2各組大鼠免疫組化結果比較四組大鼠MMP-9、COX-2和IL-6水平的總體差異有統計學意義(P<0.05)。模型組、柳氮磺胺吡啶和沙利度胺組MMP-9、COX-2和IL-6水平均高于空白對照組(P<0.05)。模型組MMP-9、COX-2和IL-6水平較柳氮磺胺吡啶和沙利度胺組高，柳氮磺胺吡啶組各指標水平較沙利度胺組高(P<0.05)。見表2。

表2　各組大鼠免疫組化結果比較

3討論

近年來，UC的發病率也逐漸升高，一般認為是由遺傳、環境和免疫等多種因素改變所致的過于活躍的黏膜免疫應答引起，主要侵及直腸、結腸黏膜層和黏膜下層，以ECM的降解和潰瘍形成為主要特點〔5〕。腸道通透性是反映腸道屏障能力的重要指標，通透性的改變可能是UC反復發作的重要因素之一。MMPs裂解ECM成分可改變腸黏膜通透性，因此在腸炎癥的發生中起重要作用，MMP-9通過降解基底膜中的Ⅳ型膠原，阻止炎癥的擴散〔6〕。薛永舉等〔7〕在炎癥性腸病研究中均發現MMP-9和UC的活動呈正相關，能夠降低黏膜的防御功能從而誘發結腸炎癥。此外，COX-2、IL-6等多種細胞因子也參與了UC的發展。COX-2基因位于第1號染色體，正常生理情況下機體組織中分布極少，在外界刺激下，產生大量COX-2，促進組織合成致炎性前列腺素，尤其是前列腺素E2，介導發熱、疼痛等炎癥病理生理過程〔8〕。相關研究發現〔9〕，UC患者結腸組織炎性細胞中COX-2表達顯著升高,提示COX-2在UC病理生理過程中發揮重要作用。IL-6又稱前炎癥細胞因子，主要由T細胞、B細胞、巨噬細胞等多種細胞產生，可通過體液免疫、細胞免疫等途徑影響宿主防御功能和組織損傷，具有急性期反應和調節免疫應答功能，在抗感染免疫反應中起重要作用〔10〕。IL-6的升高與疾病的活動期、腫瘤的發展變化等密切相關，是UC發展過程中的重要炎性遞質。

目前，UC的治療主要是通過阻斷炎癥反應、調節免疫功能的發病機制的治療，依據疾病嚴重程度、病變部位等制定個體化治療方案，控制炎癥，緩解癥狀，防止并發癥。常用治療藥物包括氨基水楊酸制劑(如5-氨基水楊酸、柳氮磺胺吡啶等)、糖皮質激素、免疫抑制劑以及其他輔助治療藥物等〔11〕。沙利度胺最早被用于治療早孕反應，但因證實與海豹樣畸形兒有關致其撤市。近年來，多項研究發現該藥具有免疫調節、抗感染、抗血管生成作用，并用于腫瘤治療〔12〕。

本研究結果可能是造模后，大鼠處于急性病變期，出現運動減少、進食量減少、體重下降、稀便伴有血便等癥狀。本研究提示沙利度胺療效更好。研究還說明沙利度胺下調相關指標表達作用更好，沙利度胺能夠調節UC大鼠免疫功能。

綜上所述，沙利度胺治療UC大鼠能夠顯著降低其DAI水平和MMP-9、COX-2、IL-6的表達，且其治療效果優于柳氮磺胺吡啶，但其安全性有待進一步探討。

4參考文獻

1Latella G,Rogler G,Bamias G,etal.Results of the 4th scientific workshop of the ECCO (I): pathophysiology of intestinal fibrosis in IBD〔J〕.J Crohns Colitis,2014；8(10):1147-65.

2Kofla-Dlubacz A,Matusiewicz M,Krzystek-Korpacka M,etal.Correlation of MMP-3 and MMP-9 with Crohn's disease activity in children〔J〕.Dig Dis Sci,2012；57(3):706-12.

3羅涵青,錢家鳴.沙利度胺在頑固性炎癥性腸病中的應用〔J〕.中華內科雜志,2012；51(11):905-6.

4魏妮,郭長存,沙素梅,等.利用表達譜基因芯片篩選潰瘍性結腸炎差異表達基因〔J〕.現代生物醫學進展,2015；15(1):53-7.

5武顏榮.沙利度胺片治療潰瘍性結腸炎并腸病性關節炎觀察〔J〕.浙江臨床醫學,2012；14(11):1415-6.

6Diamanti A,Knafelz D,Panetta F,etal.Thalidomide as rescue therapy for acute severe ulcerative colitis〔J〕.Eur Rev Med Pharmacol Sci,2014；18(12):1690-3.

7薛永舉,梅俏,丁浩,等.潰瘍性結腸炎患者外周血中MMP-2、MMP-9與腸黏膜通透性關系的臨床研究〔J〕.安徽醫科大學學報,2014；49(4):495-8.

8Sakthivel KM,Guruvayoorappan C.Amentoflavone inhibits iNOS,COX-2 expression and modulates cytokine profile,NF-κB signal transduction pathways in rats with ulcerative colitis〔J〕.Int Immunopharmacol,2013；17(3):907-16.

9鄭秀霞.沙利度胺對葡聚糖硫酸鈉誘導的大鼠潰瘍性結腸炎療效觀察〔D〕.福州：福建醫科大學碩士論文,2011.

10Diamanti A,Capriati T,Papadatou B,etal.The clinical implications of thalidomide in inflammatory bowel diseases〔J〕.Expert Rev Clin Immunol,2015；11(6):699-708.

11Yang C,Singh P,Singh H,etal.Systematic review:thalidomide and thalidomide analogues for treatment of inflammatory bowel disease〔J〕.Aliment Pharmacol Ther,2015；41(11):1079-93.

12卜玉杰.沙利度胺治療潰瘍性結腸炎療效觀察〔J〕.中國實用醫藥,2015；10(11):162-3.

〔2015-07-11修回〕

(編輯袁左鳴)

〔中圖分類號〕R57

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)07-1594-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.07.025

第一作者：黃鶴(1971-)，男，副主任醫師，主要從事HP根除的現狀與挑戰方面的研究。