參益安神片改善小鼠學習記憶的作用及其機制

宋　媛　蔡廣知　姜麗嬌　張雪萍　張宇翔　王莎莎　龐宇涵　貢濟宇

(長春中醫藥大學，吉林　長春　130117)

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參益安神片改善小鼠學習記憶的作用及其機制

宋媛蔡廣知姜麗嬌張雪萍張宇翔王莎莎龐宇涵貢濟宇

(長春中醫藥大學，吉林長春130117)

〔摘要〕目的探討復方制劑參益安神片改善記憶作用的藥效學及其作用機制。方法采用水迷宮試驗、避暗實驗、跳臺實驗觀察空白對照組、陽性對照組、復方制劑參益安神片高(1.607 g/kg)、中(0.536 g/kg)、低(0.269 g/kg)劑量組對小鼠改善記憶的作用；采用熒光法對小鼠腦內5-羥色胺(5-HT)、多巴胺(DA)、去甲腎上腺素(NE)進行含量測定，初步研究復方制劑參益安神片改善小鼠記憶的作用機制。結果避暗試驗中劑量組、高劑量組小鼠的潛伏期明顯延長(P<0.05)，錯誤次數、進入暗室的動物數也明顯減少(P<0.05)；水迷宮試驗高劑量、中劑量組小鼠2 min內到終點的動物明顯增加(P<0.05)；跳臺試驗潛伏期有明顯延長作用(P<0.05)；腦5-HT、DA、NE含量與空白組比較顯著增加。結論復方制劑參益安神片具有明顯改善記憶的功能,其機制可能與5-HT、DA、NE的相互調節有關。

〔關鍵詞〕參益安神片；學習記憶；5-羥色胺；多巴胺；去甲腎上腺素

參益安神片是在參芪五味子片〔1〕的基礎上，結合文獻報道〔2，3〕按照中醫理論設計而成的處方，由人參、五味子、酸棗仁、益智四種中藥材組成。人參和益智仁為益智安神的常用藥，酸棗仁具有養心安神、斂汗的功效，它不僅是治療失眠不寐之藥，還能滋補強壯，久服能養心健腦；加用五味子，有酸斂收澀、益氣生津等功效，善治心腎兩經的虛虧或不調引起的心神不安、驚悸失眠等。但復方制劑是否具有明顯的改善記憶、鎮靜催眠的作用未見報道。本文主要對復方制劑參益安神片改善記憶作用進行藥效學研究，并探討其作用機制。

1材料與方法

1.1實驗藥品及試劑復方制劑參益安神片，自制。含生藥量2 g/片(所需藥材均購于長春市宏檢大藥房)；棗東安神顆粒(北京優你特藥業有限公司)批號：130501；實驗所需藥物均以蒸餾水配制所需濃度。酸性正丁醇、正庚烷、鄰苯二甲醛-鹽酸溶液、碘試液、半胱氨酸溶液、pH7.2的磷酸鹽緩沖液(PBS)、乙二胺四乙酸(EDTA)試液。

1.2動物健康昆明鼠種(KM)，18～22 g，雌雄各半，購于吉太小動物用品經銷處：受試小鼠引進后置于長春中醫藥大學動物實驗室飼養。溫度：(20±3)℃,相對濕度：50%～70%。

1.3實驗儀器AL 204萬分之一天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；CaryEclipse分子熒光光度計(鄭州中譜儀器設備有限公司)R205恒溫水浴鍋(上海申生科技有限公司)；T18 basic組織勻漿儀(廣州儀科實驗室技術有限公司)；KQ3200DB數控超聲清洗器(廣州儀科實驗室技術有限公司)；YLS3T型跳臺儀(廣州儀科實驗室技術有限公司);BA-200小鼠避暗儀(廣州儀科實驗室技術有限公司);Morris水迷宮實驗系統(北京中科院生理所)。

1.4方法將50只小鼠隨機分為空白對照組、陽性對照組、高劑量組(1.606 5 g/kg)、中劑量組(0.535 5 g/kg)、低劑量組(0.267 8 g/kg)，3個劑量組分別灌胃給藥參益安神片，空白對照組給予等量生理鹽水，陽性對照組給予棗東安神顆粒，灌胃15 d后，開始對各組小鼠進行訓練并測定。

1.4.1跳臺試驗〔4〕分別將小鼠放在絕緣平臺上(計時開始)。記錄第2次跳下平臺的潛伏期、3 min內的跳下平臺的錯誤次數和各組跳下平臺的動物數。訓練3 d后開始測試。

1.4.2避暗實驗將小鼠置于電擊室，背對洞口，先給予條件刺激(燈光)15 s，在亮燈10 s后開始通電5 s(電擊強度為40 V、50 Hz)。記錄每只小鼠進入暗室的潛伏期、5 min內進入暗室錯誤的次數和各組進入暗室的動物數。并計算5 min內進入暗室(錯誤反應)的百分率，訓練5 d后開始測試。

1.4.3水迷宮實驗從訓練第1天開始，每批實驗各有1只小鼠給藥,平行操作,5 min后再給第二批小鼠注射,以此類推。每天訓練4次,每次隨機選擇一個入水點,觀察并記錄小鼠尋找并爬上平臺的路線圖及所需時間(潛伏期)。4次訓練小鼠分別從4個不同的入水點入水，如果小鼠在120 s內未找到平臺，需將其引至平臺。這時潛伏期計為120 s，每次訓練間隔60 s，以4次的平均時間及路程作為每天的訓練成績，連續訓練5 d后開始測定。

1.4.4復方制劑參益安神片片對小鼠腦內單胺類神經遞質去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羥色胺(5-HT)的影響〔5，6〕

1.4.4.1腦組織NE含量測定上述實驗小鼠50只，斷頭取腦，將腦組織用冰生理鹽水清洗后吸干水分，天平稱取小鼠大腦重量，將小鼠大腦沿腦中線切開，取左半腦組織加入2 ml酸性正丁醇后勻漿，2 500 r/min離心5 min，分別取上清液0.4 ml,加正庚烷0.8 ml，加0.1 mol/L的HCl 0.2 ml超聲1 min，2 500 r/min離心5 min分別取底層水相。水相50 μl,加PBS 150 μl加EDTA 40 μl,加新配制的碘液20 μl，混勻，靜置3 min，分別加堿性磷酸鈉40 μl，混勻，靜置3 min，分別加醋酸40 μl，混勻，80℃水浴10 min，冷卻即得。吸取各樣品200 μl置96孔板內，進行含量測定，激發波長382/488。

1.4.4.2腦組織中DA的含量測定上述實驗小鼠50只，斷頭取腦，將腦組織用冰生理鹽水清洗后吸干水分，天平稱取小鼠大腦重量，將小鼠大腦沿腦中線切開，去左半腦組織加入2 ml酸性正丁醇后勻漿，分別取上清液0.4 ml,加正庚烷0.8 ml，加0.1 mol/L的HCl 0.2 ml超聲1 min，2 500 r/min離心5 min分別取底層水相。水相50 μl,加PBS 150 μl加EDTA 40 μl,加新配制的碘液20 μl，混勻，靜置3 min，分別加堿性磷酸鈉40 μl，混勻，靜置3 min，分別加5 mol/L醋酸40 μl，混勻，100℃水浴15 min，冷卻即得。精密吸取各樣品200 μl置96孔板內，進行含量測定，激發波長為325/385。記錄結果。

1.4.4.3腦組織中5-HT的含量測定上述實驗小鼠50只，斷頭取腦，將腦組織用冰生理鹽水清洗后吸干水分，天平稱取小鼠大腦重量，將小鼠大腦沿腦中線切開，去左半腦組織加入2 ml酸性正丁醇后勻漿，分別取上清液0.4 ml,加正庚烷0.8 ml，加0.1 mol/L的HCl 0.2 ml超聲1 min，2 500 r/min離心5 min分別取底層水相。取水相0.4 ml，加入0.25%半胱氨酸(新配)0.1 ml，再加入0.002%OPT-10 NHCl 3 ml。混勻，沸水浴10 min，冷卻即得。精密吸取各樣品200 μl置96孔板內，進行含量測定，激發波長為368/480。

1.5統計學方法采用SPSS17.0統計軟件進行t檢驗。

2結果

2.1復方制劑參益安神片跳臺實驗結果陽性對照組、中劑量組潛伏期與錯誤次數與空白對照組比較顯著差異(P<0.05或P<0.01)，高劑量組潛伏期與錯誤次數與空白對照組比較有極顯著性差異(P<0.01)。見表1。

表1　復方制劑參益安神片對小鼠跳臺實驗及避暗實驗的影響±s,n=10)

與空白對照組比較：1)P<0.05；2)P<0.01；下表同

2.2復方制劑參益安神片避暗實驗結果中劑量組錯誤次數與空白對照組比較有顯著差異(P<0.05)，高劑量組、陽性對照組錯誤次數與空白對照組比較有極顯著性差異(P<0.01)，其他4組測試潛伏期與空白對照組比較均有增長。見表1。

2.3復方制劑參益安神片水迷宮實驗結果中劑量組、高劑量組實驗完成時間〔(69.84±23.37)s、(65.45±22.98)s〕與空白對照組〔(114.82±7.96)s〕比較差異顯著(P<0.05)。陽性對照組為(101.72±26.32)s，低劑量組為(80.50±27.65)s。

2.4小鼠腦內單胺類神經遞質測定結果見表2。高、中劑量

表2　復方制劑對小鼠腦內單胺類神經

組腦內5-HT、DA、NE含量與空白對照組比較顯著增加(P<0.05)，低劑量組與空白對照組比較均升高，但無顯著差異(P>0.05)。

3討論

參益安神片選取了四味常用的中藥進行配伍，通過避暗試驗、跳臺試驗、水迷宮試驗可以看出無論是錯誤次數還是潛伏期給藥組都有所改善，其藥效與陽性對照藥對比藥效相當，因而從藥效學角度看來，參益安神片的改善學習記憶作用可以得到較充分的肯定，有較好的益智作用。

單胺類神經遞質包括兒茶胺和吲哚胺兩類，前者包括DA、NE和腎上腺素，后者為5-HT，大腦皮質、紋狀體中存在大量的DA和5-HT能神經末梢，他們對高級活動如感情、學習、記憶起重要作用。DA含量下降是腦功能衰老的表現之一，學習記憶增強常伴有NE、DA的增加，但對5-HT的報道還不是特別明確。參益安神片片改善小鼠學習記憶能力可能與5-HT、DA、NE的相互調節有關。相關文獻報道〔7〕，神經中樞內的DA代謝會影響NE的代謝,NE可能調節廣泛腦區的突觸傳入活動，增大環境中有意義的信息傳入，而抑制其他傳入刺激的干擾，從而提高注意力，增強學習能力。

本實驗采用熒光法對神經遞質的含量進行測定用于研究改善記憶的作用機制，熒光法與液相色譜法進行比較，熒光法實驗能提高實驗效率，目前試劑盒的應用也越來越廣泛,可以在后續的機制研究試驗中進行優選。

4參考文獻

1祝洪艷,何忠梅,王國麗,等.參芪五味子片對神經系統的藥理作用及臨床研究〔J〕.吉林中醫藥,2014;34(8):842-4.

2李廷利,于爽,辛靜.刺人參的有效部位改善睡眠作用及作用機制的研究〔J〕.中藥藥理與臨床,2012;28(5):105-8.

3蔣益萍,張巧艷,張宏,等.正交試驗優選五味子木脂素類成分的提取工藝〔J〕.中成藥,2013;35(11):2390-4.

4杜正彩,鄧家剛.復方絞股藍益智顆粒改善記憶作用藥效學研究〔J〕.中國實驗方劑學雜志,2012;18(15):250-3.

5周桂媛.當歸有效成分抗早老性癡呆藥理作用及分子機制〔J〕.實用中醫內科雜志,2013;27(2):122-3.

6魏小娟,許建華.熒光-反相高效液相色譜法同時測定小鼠腦組織中3種單胺類神經遞質〔J〕.海峽藥學,2010;22(4):61-3.

7杜暉.運動對去甲腎上腺素的影響及去甲腎上腺素在記憶中的作用〔J〕.科技信息(學術研究),2007;(36):243-5.

〔2015-07-26修回〕

(編輯袁左鳴)

〔中圖分類號〕R285.5

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)07-1587-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.07.022

通訊作者：貢濟宇(1960-)，女，碩士生導師，教授，主要從事藥物分析學研究。

基金項目：吉林省醫藥產業發展專項資金計劃(No.20130727020YY)

第一作者：宋媛(1989-)，女，碩士，主要從事中藥分析學研究。