艾灸預(yù)處理對(duì)急性力竭運(yùn)動(dòng)大鼠心肌損傷及蛋白激酶C的影響

熊　英　顧一煌　吳云川

(南京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)一級(jí)學(xué)科，江蘇　南京　210046)

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艾灸預(yù)處理對(duì)急性力竭運(yùn)動(dòng)大鼠心肌損傷及蛋白激酶C的影響

熊英顧一煌吳云川

(南京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)一級(jí)學(xué)科，江蘇南京210046)

〔摘要〕目的探討艾灸預(yù)處理對(duì)急性力竭運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的心肌損傷的保護(hù)作用及蛋白激酶C(PKC)的影響。方法健康雄性SD雄性大鼠40只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組(C組)、艾灸組(M組)、力竭組(E組)、艾灸力竭組(ME組)和艾灸力竭+PKC抑制劑組(ME+CHE組)5組。在一次性游泳急性力竭模型的基礎(chǔ)上，用艾灸預(yù)處理進(jìn)行干預(yù)，并注射PKC抑制劑白屈菜紅堿(CHE)，采用透射電鏡觀察心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化，運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測(cè)大鼠心肌PKC蛋白水平及其活化情況。結(jié)果①E組心肌超微結(jié)構(gòu)損傷改變明顯，ME組心肌超微結(jié)構(gòu)損傷較E組輕，而ME+CHE組心肌超微結(jié)構(gòu)損傷程度與E組相似。②與C組比較，M組和ME組PKC蛋白水平無(wú)明顯變化，E組和ME+CHE組p-PKC水平均有明顯升高(P<0.05)；與E組比較，ME組PKC水平有明顯下降(P<0.05)，ME+CHE組水平無(wú)明顯變化；與ME組比較，ME+CHE組PKC水平有明顯上升(P<0.05)。③與C組p-PKC水平比較，M組無(wú)明顯變化，E組、ME組和ME+CHE組水平均有明顯升高(P<0.05)；與E組比較，ME組p-PKC水平有明顯下降(P<0.05)；與ME組比較，ME+CHE組P-PKC水平有明顯上升(P<0.05)。結(jié)論急性力竭運(yùn)動(dòng)所致的心肌損傷與PKC的過(guò)度表達(dá)和活化有關(guān)，艾灸預(yù)處理對(duì)急性力竭所致的心肌損傷有保護(hù)作用，阻止PKC的過(guò)度表達(dá)和活化可能是其起效的機(jī)制之一。

〔關(guān)鍵詞〕艾灸；預(yù)處理；心肌超微結(jié)構(gòu)；蛋白激酶C(PKC)

艾灸是祖國(guó)醫(yī)學(xué)“治未病”的常用手段，早在古代即有艾灸防治心血管疾病的大量記載，本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)艾灸預(yù)處理對(duì)運(yùn)動(dòng)性心肌損傷有一定的防治作用。蛋白激酶C(PKC)是預(yù)處理心肌保護(hù)效應(yīng)中重要的中介物質(zhì)之一〔1〕，但也有研究表明PKC過(guò)度活化可加重心肌缺血再灌注(I/R)損傷的程度〔2〕。鑒于以往的研究結(jié)果，本研究在大鼠急性力竭游泳運(yùn)動(dòng)模型的基礎(chǔ)上，運(yùn)用艾灸預(yù)處理進(jìn)行干預(yù)，并使用PKC抑制劑白屈菜紅堿(CHE)，觀察艾灸預(yù)處理對(duì)急性力竭大鼠心肌損傷的保護(hù)作用及心肌PKC表達(dá)及活化的影響。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用健康雄性SD大鼠37只，體重190~210 g。大鼠常規(guī)分籠飼養(yǎng)，一組一籠，均以標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類(lèi)動(dòng)物飼料飼養(yǎng)，自由飲食。室溫保持在20℃～22℃，相對(duì)濕度45%～50%，光照時(shí)間為12 h/d。大鼠參照隨機(jī)數(shù)字表分為5組，包括正常對(duì)照組(C 組，n=7)、艾灸組(M組，n=8)、力竭組(E組，n=6)、艾灸力竭組(ME組，n=8)、艾灸力竭+CHE組(ME+CHE組，n=8)。

1.2力竭模型的建立力竭模型參照彭澤胄等〔3〕的文獻(xiàn)報(bào)道，先進(jìn)行2 d適應(yīng)性游泳(20 min/次)，而后進(jìn)行一次性力竭游泳運(yùn)動(dòng)，游泳大鼠尾部負(fù)重為體重3%，直至力竭。力竭標(biāo)準(zhǔn)：連續(xù)沉入水中超過(guò)10 s，撈出后置于平面不能完成翻正反射。在相對(duì)較短時(shí)間內(nèi)力竭的大鼠，將其撈出休息5 min后，再繼續(xù)進(jìn)行游泳運(yùn)動(dòng)，使每次運(yùn)動(dòng)時(shí)間不少于2 h。游泳后，迅速用干毛巾擦干水分，電吹風(fēng)吹干后，放回籠中休息。

1.3分組所有大鼠進(jìn)入動(dòng)物房后，先適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，各組在同一時(shí)間取材。C組：在E組大鼠力竭游泳前，適應(yīng)性游泳2 d，次日麻醉取材。M組：從E組大鼠游泳前7 d開(kāi)始，進(jìn)行艾灸預(yù)處理，取大鼠單側(cè)“內(nèi)關(guān)”、“足三里”，兩側(cè)輪換，每穴各灸15 min，共灸30 min，每天1次，其他無(wú)特殊處理，艾灸第6、7天進(jìn)行適應(yīng)性游泳，次日麻醉取材。E組：在大鼠力竭游泳前，適應(yīng)性游泳2 d，次日一次性游泳至力竭，在訓(xùn)練結(jié)束30 min后進(jìn)行取材。ME組：訓(xùn)練方案同E組，從力竭游泳前7 d開(kāi)始進(jìn)行艾灸預(yù)處理，方法同M組，艾灸第6、7天進(jìn)行適應(yīng)性游泳，次日進(jìn)行一次性游泳至力竭。在訓(xùn)練結(jié)束30 min后進(jìn)行取材。ME+CHE組:處理同ME組，但每天在艾灸前給大鼠腹腔注射CHE(5 mg/kg)，而后開(kāi)始艾灸。

1.4取材和電鏡標(biāo)本制備將大鼠用0.4%戊巴比妥鈉(1 ml/100 g體重)腹腔注射麻醉后，呈仰臥位固定，打開(kāi)胸腔，暴露心臟，取出心臟，取左心室心尖心內(nèi)膜下組織1 mm3，3%戊二醛固定和1%鋨酸后固定(4℃)，逐級(jí)酒精-丙酮脫水，Epon812樹(shù)脂包埋，0.5%美藍(lán)染色，半薄定位。超薄切片機(jī)切片，切片厚50~60 nm，醋酸鈾-檸檬酸鉛復(fù)染，制成電鏡標(biāo)本，在Hitach1透射電鏡下觀察攝片。

1.5ELISA法檢測(cè)PKC及p-PKC蛋白表達(dá)取樣品在4℃10 000 r/min離心5 min，取上清，用 BCA 法對(duì)蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定，采用 ELISA法在酶標(biāo)儀上讀出 OD 值，所有 OD 值減去除零孔值后再行計(jì)算。以標(biāo)準(zhǔn)品的 OD 值使用相應(yīng)軟件繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品含量。

1.6數(shù)據(jù)處理采用SPSS11.5軟件行單因素方差分析、LSD檢驗(yàn)，方差不齊用DunnettT3進(jìn)行檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1各組心肌細(xì)胞透射電鏡觀察結(jié)果C組心肌細(xì)胞超微結(jié)

構(gòu)正常，肌膜完整，肌原纖維排列規(guī)則，線粒體呈帶狀分布，排列整齊，形態(tài)正常，嵴清晰。M組與C組沒(méi)有明顯差異。E組心肌超微結(jié)構(gòu)改變明顯，細(xì)胞膜雖完整，但肌原纖維排列不規(guī)則并有斷裂處，纖維間空隙增大，線粒體腫脹嚴(yán)重，或線粒體溶解破裂，呈空泡狀，嵴消失。ME組心肌超微結(jié)構(gòu)損傷較E組程度減輕，細(xì)胞膜完整，肌原纖維排列較規(guī)則，但間隙較大，線粒體腫脹減輕，嵴較清晰。而ME+CHE組心肌超微結(jié)構(gòu)也有明顯改變，其損傷程度與E組相似。見(jiàn)圖1。

2.2ELISA法檢測(cè)各組心肌組織PKC及p-PKC蛋白含量與C組比較，M組PKC蛋白水平無(wú)明顯變化，ME組水平雖有上升，但與C組沒(méi)有明顯差異，E組和ME+CHE組PKC水平均有明顯升高(P<0.05)；與E組比較，ME組PKC水平有明顯下降(P<0.05)，ME+CHE組水平無(wú)明顯變化；與ME組比較，ME+CHE組PKC水平有明顯上升(P<0.05)。大鼠心肌p-PKC的ELISA檢測(cè)結(jié)果比較(見(jiàn)表1)，與C組比較，M組p-PKC蛋白水平雖有上升，但無(wú)明顯差異，E組、ME組和ME+CHE組水平均有明顯升高(P<0.05)；與E組比較，ME組p-PKC水平有明顯下降(P<0.05)，ME+CHE組水平無(wú)明顯變化；與ME組比較，ME+CHE組PKC水平有明顯上升(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1　大鼠心肌組織PKC及p-PKC蛋白水平

1)與C組比較，2)與E組比較，3)與ME組比較：P<0.05

圖1　各組心肌細(xì)胞透射電鏡觀察結(jié)果(×2 000)

3討論

超負(fù)荷訓(xùn)練的運(yùn)動(dòng)量可能接近極度的疲勞或力竭，也是導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)員猝死的原因之一〔4,5〕。研究認(rèn)為運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練中，心臟肯定存在缺血、缺氧現(xiàn)象，但在其自我保護(hù)機(jī)制的作用下不會(huì)使心肌損傷，而一旦運(yùn)動(dòng)負(fù)荷超出了機(jī)體的防御能力與心臟的耐受，可造成心肌損傷。急性力竭運(yùn)動(dòng)可使心肌出現(xiàn)脂質(zhì)過(guò)氧化加強(qiáng)、鈣離子(Ca2+)超載等現(xiàn)象，致心肌損傷。由于運(yùn)動(dòng)后心肌損傷的時(shí)相性變化與臨床上心肌I/R損傷的改變一致，故這種心肌損傷又稱(chēng)為運(yùn)動(dòng)性I/R損傷〔6〕。

預(yù)處理可以調(diào)動(dòng)機(jī)體內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，對(duì)一些疾病起到預(yù)防和治療的作用。1986年Murry等〔7〕提出缺血預(yù)處理對(duì)心臟有保護(hù)作用以來(lái),人們開(kāi)始通過(guò)各種預(yù)處理手段來(lái)調(diào)動(dòng)臟器內(nèi)源性保護(hù)作用。艾灸預(yù)處理又被稱(chēng)為“逆灸”，是中醫(yī)“治未病”的重要內(nèi)容，“無(wú)病而先針灸曰逆。逆,未至而迎之也”。早在古代即有艾灸防治心血管疾病的大量記載，現(xiàn)代研究亦表明艾灸對(duì)于心肌I/R具有保護(hù)作用〔8〕。本課題組在前期的研究中也發(fā)現(xiàn)艾灸能通過(guò)提高大鼠的心肌抗氧化能力，從而對(duì)心肌損傷有一定的保護(hù)作用〔9〕。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，力竭運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷、心肌細(xì)胞腫脹、線粒體呈現(xiàn)空泡狀、嵴消失。而艾灸預(yù)處理后對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)大鼠的心肌細(xì)胞有一定的保護(hù)作用，可見(jiàn)心肌細(xì)胞腫脹及線粒體的損傷程度等均比力竭大鼠有明顯的減輕，但艾灸預(yù)處理對(duì)沒(méi)有參與力竭的大鼠心肌無(wú)明顯影響。PKC是預(yù)適應(yīng)心肌保護(hù)效應(yīng)中重要的中介物質(zhì)之一。近年研究表明,PKC的激活、轉(zhuǎn)位介導(dǎo)了心肌缺血預(yù)處理效應(yīng),而其抑制劑則能消除此種保護(hù)效果〔10〕,故而有人提出PKC介導(dǎo)的預(yù)處理中蛋白磷酸化可能是預(yù)處理細(xì)胞保護(hù)作用的重要環(huán)節(jié),早期的PKC活化即在整個(gè)預(yù)處理中起關(guān)鍵作用。但艾灸預(yù)處理如何影響急性力衰運(yùn)動(dòng)中心肌PKC的表達(dá)活化還不得而知。

本研究結(jié)果顯示，力竭運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致大鼠心肌PKC及p-PKC蛋白水平均有顯著升高，而艾灸預(yù)處理使其蛋白水平均有顯著降低。已有研究表明，雖然δPKC的活化是IP發(fā)揮心肌保護(hù)效應(yīng)的環(huán)節(jié)之一，但過(guò)度活化可加重心肌I/R損傷的程度，抑制心肌I/R時(shí)再灌注期的δPKC活性可以緩解心肌的損傷〔11~13〕;而過(guò)度表達(dá)和活化的αPKC也會(huì)使心肌收縮能力受損而加重心肌損傷〔14〕。所以，推測(cè)，PKC含量過(guò)多及活化過(guò)度可能是其導(dǎo)致急性力竭運(yùn)動(dòng)后心肌損傷的機(jī)制之一，而艾灸預(yù)處理能抑制過(guò)度升高及活化的PKC，而對(duì)心肌損傷產(chǎn)生一定的保護(hù)作用。由于自由基是 PKC 調(diào)控中的關(guān)鍵物質(zhì)之一，而前期的研究也表明艾灸能通過(guò)提高大鼠的心肌抗氧化能力，對(duì)心肌損傷有一定的保護(hù)作用〔9〕，所以筆者認(rèn)為，艾灸預(yù)處理可能通過(guò)改善力竭運(yùn)動(dòng)心肌的氧化應(yīng)激狀態(tài)而使PKC及其活化水平降低。

CHE是PKC的選擇性抑制劑，可與 PKC 的催化部位結(jié)合而使其失活，抑制PKC的磷酸化〔15〕。在本研究中，注射CHE使艾灸預(yù)處理后力竭大鼠心肌PKC及p-PKC蛋白的表達(dá)明顯升高，提示CHE抑制了艾灸預(yù)處理后大鼠PKC及 p-PKC蛋白表達(dá)的下降，這可能是其導(dǎo)致艾灸預(yù)處理心肌保護(hù)作用消失的主要原因。有研究發(fā)現(xiàn)，PKC抑制劑 CHE 能阻斷大鼠在運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)即刻和24 h δPKC下降的趨勢(shì)〔16〕，這與本研究的結(jié)果有相似之處，不過(guò)預(yù)處理手段截然不同。

另有研究證實(shí)CHE還有其獨(dú)立的生物學(xué)作用，CHE 能誘導(dǎo)自由基的產(chǎn)生，而此過(guò)程與抑制PKC無(wú)關(guān)；而且其誘導(dǎo)自由基的產(chǎn)生所致大鼠心肌凋亡的作用比抑制 PKC 的作用更顯著，而自由基又是促進(jìn)PKC活化的重要物質(zhì)〔17~19〕。

本研究中注射 CHE 后使艾灸預(yù)處理的力竭大鼠心肌PKC蛋白表達(dá)和活化增加，筆者推測(cè)可能是一方面由于 CHE 阻斷PKC 活性后致PKC 在膜上的停留時(shí)間增加，同時(shí)誘導(dǎo)PKC 蛋白的進(jìn)一步表達(dá)，使PKC 補(bǔ)償性增多；另一方面由于CHE獨(dú)立誘導(dǎo)自由基產(chǎn)生，促使PKC水平和活化增加，從而使艾灸預(yù)處理作用不能正常發(fā)揮。

綜上，急性力竭游泳運(yùn)動(dòng)造成大鼠一定程度的心肌損傷，艾灸預(yù)處理對(duì)正常大鼠沒(méi)有明顯影響，但能一定程度保護(hù)力竭運(yùn)動(dòng)大鼠的心肌，而注射CHE會(huì)影響艾灸預(yù)處理對(duì)心肌的保護(hù)作用。力竭運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致心肌PKC的過(guò)度表達(dá)和活化，可能是心肌損傷的機(jī)制之一，艾灸預(yù)處理明顯抑制過(guò)度表達(dá)的PKC及其活化，可能是艾灸預(yù)處理心肌保護(hù)的機(jī)制之一，CHE顯著阻礙了艾灸預(yù)處理對(duì)PKC水平升高及其活化的抑制作用，其機(jī)制可能與其補(bǔ)償性增加和獨(dú)立誘導(dǎo)自由基的作用相關(guān)。

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〔2014-12-03修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢(mèng)園)

〔中圖分類(lèi)號(hào)〕R245

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)07-1575-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.07.017

基金項(xiàng)目：江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目(2014年)；南京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)一級(jí)學(xué)科開(kāi)放課題資助(YS2012ZYX407)；江蘇省高校自然科學(xué)研究面上資助項(xiàng)目(11KJB360005)

第一作者：熊英(1975-)，女，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事針灸推拿研究。