喉腫瘤相關成纖維細胞促進原代喉鱗狀細胞癌細胞體外生長

王　媚　吳春萍　曹曉娟　鄭文偉　范國康

(1浙江大學醫學院附屬第二醫院耳鼻咽喉科　杭州　310009;2上海中醫藥大學附屬市中醫醫院耳鼻咽喉科　上海　200071;

3復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫院頭頸外科　上海　200031;4嘉興學院附屬第二醫院耳鼻咽喉科　嘉興　314000)

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喉腫瘤相關成纖維細胞促進原代喉鱗狀細胞癌細胞體外生長

王媚1,2▲吳春萍3▲曹曉娟4鄭文偉4范國康1△

(1浙江大學醫學院附屬第二醫院耳鼻咽喉科杭州310009;2上海中醫藥大學附屬市中醫醫院耳鼻咽喉科上海200071;

3復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫院頭頸外科上海200031;4嘉興學院附屬第二醫院耳鼻咽喉科嘉興314000)

【摘要】目的驗證喉腫瘤相關成纖維細胞 (cancer associated fibroblasts,CAFs)對原代培養的喉鱗狀細胞癌 (laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC)細胞的體外生長是否有促進作用。方法選取20例喉癌臨床標本進行原代培養,將生長出的原代喉癌細胞中的CAFs通過差速消化法去除后繼續單獨培養,相差顯微鏡觀察喉癌細胞在傳代培養過程中的形態學變化,流式細胞儀檢測喉癌細胞在傳代過程中凋亡細胞比例的變化,Western blot檢測喉癌細胞在傳代過程中凋亡蛋白Caspase 3表達水平的變化,以始終與CAFs共培養傳代的喉癌細胞作為對照。結果與CAFs分離后喉癌原代細胞在體外傳代培養過程中生長活性很快下降,多數在3代以內停止生長。相差顯微鏡觀察到形態學上凋亡漂浮的喉癌細胞逐代增多,流式細胞儀檢測到的凋亡細胞比例逐代增加,Western blot檢測到的Caspase 3表達水平逐代增加;而始終與CAFs共培養生長的LSCC細胞在傳代過程中生長活性卻無明顯下降 (P<0.05)。結論喉腫瘤相關成纖維細胞對體外原代培養的LSCC細胞的生長具有明顯的促進作用。

【關鍵詞】腫瘤相關成纖維細胞;喉鱗狀細胞癌;原代培養;凋亡

腫瘤相關成纖維細胞 (cancer associated fibroblasts,CAFs)是腫瘤微環境中非常重要的基質細胞成份,通過分泌多種生長因子、炎性因子、調控抗腫瘤免疫以及與腫瘤細胞之間的相互作用來調控腫瘤的生長及侵襲轉移[1-4]。文獻表明,多種實體瘤的CAFs均能夠促進相應腫瘤細胞的體外增殖及侵襲等能力[5-7],但目前相關研究均是用實體腫瘤已建成的細胞系通過體外培養來進行的,而CAFs對于相應原代腫瘤細胞是否具有類似的調控作用國內外尚未見報道。

我們的前期研究已經在原代喉癌標本組織[8]及喉癌裸鼠移植瘤標本[9]中成功分離出了CAFs,發現其對于喉癌細胞系HEp-2細胞具有明確的促進生長、侵襲及成瘤作用,本研究擬在此基礎之上進一步研究喉癌標本組織中的CAFs對喉癌原代培養的腫瘤細胞是否具有體外促進生長的功能。此外,我們在之前的原代培養建系[10]過程中已經發現原代喉癌組織中的CAFs似乎能夠明顯抑制喉癌原代腫瘤細胞體外培養時的凋亡進程。為了證實這一假設,設計了本文的研究實驗,將原代培養的喉癌組織中的喉癌細胞和CAFs共培養及分離培養,從形態學到分子生物學水平檢測共培養及分離培養兩種條件下喉癌細胞凋亡程度的變化。我們發現,沒有CAFs的共培養,喉癌細胞很快發生凋亡,反之,喉癌細胞幾乎不發生凋亡,表明CAFs對原代培養的喉癌細胞適應新環境的生長可以起到決定性的抗凋亡作用。這樣的結果與目前文獻報道的CAFs對實體腫瘤細胞系的生長和侵襲僅具有部分促進作用不同。

臨床腫瘤細胞的遠處轉移過程中也存在著相似的現象。單個腫瘤細胞脫離原先生長的腫瘤微環境進入血液循環,然后進入非腫瘤組織的“轉移灶”生長,新的“轉移灶”沒有之前適合的生長條件,轉移而來的腫瘤細胞的生長與體外原代培養類似,在生長增殖初期非常容易凋亡。而“轉移灶”可以有先于腫瘤細胞存在的CAFs,它們與原發腫瘤部位的CAFs有不同的起源[11-12],可能會對轉移而來的腫瘤細胞的凋亡起到強有力的抑制作用,進而促進“轉移灶”的成功生長。因此,如果能夠在轉移早期針對CAFs進行靶向治療,將有希望抑制轉移而來的腫瘤細胞的早期增殖,將“轉移灶”消滅在萌芽狀態。本文的研究結果將為此種靶向治療提供初步的實驗依據。

材 料 和 方 法

喉癌標本的原代培養采集20例確診為喉鱗狀細胞癌(laryngeal squameus cell carcinoma,LSCC)的患者標本,所有標本的采集均得到復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫院倫理委員會的批準,患者均簽署知情同意書。患者中聲門上型16例,聲門型4例,均為男性,年齡45～63歲。將所采集喉癌標本組織用生理鹽水充分漂洗后依次在含有聚維酮碘 (1∶10稀釋)、硫酸慶大霉素 (1∶8稀釋)及鹽酸林可霉素 (1∶8稀釋)的生理鹽水中浸泡5 min,再將腫瘤組織充分剪碎至體積約1～2 mm3大小,移入含有Ⅳ型膠原酶 (200 U/mL,美國Sigma公司)的離心管，置于37 ℃ CO2培養箱中消化過夜。再將過夜消化后的細胞懸液離心 (147 576×g,5 min,以下同),棄去上清。然后用PBS緩沖液洗滌離心3次后加入含1%青鏈雙抗 (美國Sigma公司)及10%胎牛血清 (FBS,美國Invitrogen公司)的BEGM培養液 (瑞士Lonza公司)收集于6 mm培養皿中,置入37 ℃ CO2培養箱中培養2～7天后取出，置于倒置相差顯微鏡下觀察有無污染,細菌污染可見較多活動的微生物,真菌污染可見大量真菌絲,有污染的培養皿立即丟棄,重新采集標本進行同法培養。

CAFs的去除及原代LSCC細胞的傳代培養培養出的原代LSCC細胞及CAFs是共生長的,當兩者即將鋪滿培養皿底壁時需要進行胰酶消化傳代培養。實驗組利用差速消化法去除CAFs:吸去培養液上清,用PBS洗滌后每6 cm培養皿 (美國Corning公司)加入約1～2 mL胰酶 (美國Invitrogen公司)消化液,在相差顯微鏡下觀察當CAFs從長梭形收縮變成橢圓形,輕輕晃動可從培養皿底部脫落時立即加入含血清的培養液2 mL終止消化,棄去消化液,用PBS洗滌3次。LSCC細胞對胰酶消化反應差,仍貼壁于培養皿中,加入BEGM培養液繼續培養至匯合時可進行傳代。對照組的培養皿在消化時不將CAFs去除,原代LSCC細胞及CAFs始終共同消化和接種培養。

LSCC細胞及CAFs免疫熒光鑒定將消化后收集的LSCC細胞及CAFs接種于經多聚賴氨酸處理后的載玻片 (武漢博士德生物工程有限公司),培養24 h后觀察細胞已全部貼壁。棄去培養液,用PBS洗滌后置入4%多聚甲醛中固定15 min,再用10%羊血清封閉液 (含或不含0.3% Triton X-100)室溫封閉40 min,隨后加入如下兔抗人一抗:廣譜角蛋白 (pan-CK) (1∶400;美國Abcam公司)或波形蛋白 (vimentin) (1∶200;美國Abcam公司)或α平滑肌肌動蛋白 (α-SMA) (1∶200;美國Abcam公司)或成纖維細胞活化蛋白 (FAP) (1∶250;美國Abcam公司) 4 ℃過夜孵化。次日PBS洗滌玻片后置入FITC或CyTM3熒光標記的羊抗兔IgG (H+L) (1∶100,美國Jackson ImmunoResearch公司)室溫避光孵化1 h。PBS洗滌后常規DAPI (武漢博士德生物工程有限公司)染核,顯微鏡觀察及拍照。

傳代培養的LSCC細胞形態學觀察將去除了CAFs的LSCC細胞進行胰酶消化傳代培養,用倒置相差顯微鏡觀察每代培養的LSCC細胞的凋亡相關形態學變化并進行拍照。凋亡細胞的形態學特征為細胞由原先的鵝卵石樣貼壁狀態變得非常扁平,細胞周圍折光度消失,最終失去貼壁能力而漂浮于培養液中。始終與CAFs共培養傳代的LSCC細胞為對照。

傳代培養的LSCC細胞流式細胞儀凋亡檢測利用Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒 (南通碧云天生物技術研究所)進行凋亡檢測,把培養皿中的細胞培養液吸出置于離心管內,PBS洗滌3遍,加入胰酶消化液1～2 mL,顯微鏡下觀察至細胞收縮變圓時將之前收集的培養液加入并終止消化,輕輕吹打使貼壁細胞脫落,轉移到離心管內離心5 min,棄上清。PBS重懸,取5萬～10萬重懸細胞,離心,棄上清,加入195 μL Annexin V-FITC結合液輕輕吹打,重懸細胞,再加入5 μL Annexin V-FITC,輕輕吹打,最后加入10 μL碘化丙啶染液,輕輕混勻。室溫避光孵育15 min,隨后置于冰浴中。上機進行流式儀檢測。

傳代培養的LSCC細胞Caspase 3表達水平的Western blot檢測同上法收集懸于培養液中的細胞及貼壁細胞,離心,棄上清。加入約0.5 mL含1%PMSF的RIPA裂解液,充分吹打裂解細胞,4 ℃離心(12 000×g,5 min),取上清。BCA法進行蛋白濃度測定后進行電泳、轉膜、封閉、抗體[兔抗人Caspase 3(1∶5 000,美國Abcam公司)及HRP標記羊抗兔IgG (H+L)(1∶2 000,美國Jackson Immuno Research公司)]孵育及顯影。

結果

20例LSCC原代培養標本中發生污染的有4例,未污染的16例,16例中與CAFs分離后LSCC細胞單獨培養均在4代以內停止生長,其中1代停止生長的5例,2代停止生長的7例,3代停止生長的2例,4代停止生長的2例,以下實驗結果為4代停止生長的2例。

LSCC細胞及CAFs免疫熒光鑒定LSCC細胞為pan-CK陽性,而Vimentin陰性,表明其為上皮來源。相反,CAFs為pan-CK陰性,而Vimentin陽性,表明其為間質來源。此外CAFs為FAP及α-SMA陽性,該兩種蛋白為CAFs特異性蛋白,進一步證實了其CAFs身份 (圖1)。

傳代培養的LSCC細胞形態學觀察與CAFs分離后LSCC細胞在傳代過程中形態學發生顯著變化,未傳代的原代LSCC細胞呈鵝卵石樣貼壁生長,形態飽滿,折光度好,可分散生長;傳代后LSCC細胞常成簇生長,形態逐漸變得扁平,折光度下降,胞質出現較大的空泡,貼壁能力下降,最終失去貼壁能力而漂浮于培養液中。始終與CAFs共培養的LSCC細胞在傳代過程中形態學無顯著變化 (圖2)。

傳代培養的LSCC細胞流式細胞儀凋亡檢測流式細胞儀檢測到脫離了CAFs單獨培養的LSCC細胞凋亡細胞的比例隨傳代而逐代增加,傳至第3代時,其早期凋亡及晚期凋亡細胞的總和已達到近80%,而始終與CAFs共培養的LSCC細胞在傳代過程中最終僅檢測到微量凋亡細胞 (P<0.05,圖3)。

傳代培養的LSCC細胞Caspase 3表達水平的Western blot檢測與CAFs分離培養的LSCC細胞Caspase 3蛋白表達水平隨傳代而逐代增加,而始終與CAFs共培養的LSCC細胞在傳代過程中僅檢測到微量Caspase 3表達 (P<0.05,圖4)。

The LSCC cells showed positive staining of pan-CK (A) and negative staining of Vimentin (B).In addition,the CAFs showed negative staining of pan-CK (C) and positive staining of Vimentin (D), α-SMA (E),and FAP (F).

圖1LSCC細胞及其相關成纖維細胞免疫細胞熒光鑒定

Fig 1Authentication of LSCC cells and CAFs using immunocytochemical staining

The LSCC cells cocultured with CAFs showed no significant morphalogical changes at primary (A), passage 1 (B), passage 2 (C),and passage 3 (D).In contrast,the LSCC cells separated from CAFs showed significant morphalogical changes at primary (E), passage 1 (F), passage 2 (G),and passage 3 (H) including:increasingly flattened outline,decreased capacity to attach to the flask,and increased apoptotic cells floating in the medium.Noteworthy,apoptotic cells with huge cytoplasmic vacuolewas observed (yellow arrow).

圖2兩種方法體外傳代培養過程中LSCC細胞的形態學變化

Fig 2Morphalogical changes of LSCC cells in two differentinvitroculture systems

The flow cytometry detected consistently few apoptotic LSCC cells at primary (B), passage 1 (C), passage 2 (D),and passage 3 (E) when cocultured with CAFs.In contrast,the LSCC cells separated from CAFs showed increasingly upregulated proportion of apoptotic cells at primary (G), passage 1 (H), passage 2 (I),and passage 3 (J). A and F：Blank control. K and L：Statistical analysis of apoptotic cells in two different culture system.(1)P<0.05.

圖3兩種方法體外傳代培養過程中LSCC細胞凋亡比例的變化

Fig 3Changes of apoptotic LSCC cells quantified by the flow cytometry in two differentinvitroculture systems

A：The LSCC cells cocultured with CAFs showed consistently low expression of Caspase 3 at primary,passage 1,passage 2,and passage 3. B：In contrast,the LSCC cells separated from CAFs showed increasingly enhanced expression of Caspase 3 from primary to passage 3. C and D：Statistical analysis of relative protein expression of LSCC cells in two different culture system.(1)P<0.05.

圖4兩種方法體外傳代培養過程中LSCC細胞Caspase 3表達水平的變化

Fig 4Changes of LSCC cells Caspase 3 detected by Western blot in two differentinvitroculture systems

討論

CAFs是近年來腫瘤研究研究的熱點,文獻報道的相關研究均采用實體腫瘤的細胞系進行體外培養,不同類型實體瘤中的CAFs均有部分促進相應腫瘤細胞系生長和侵襲的作用[5-7]。本文在前期研究LSCC細胞系的基礎上進一步收集LSCC標本進行原代培養并分離LSCC組織中的CAFs及原代LSCC細胞,用來驗證LSCC組織中的CAFs對LSCC原代細胞是否具有相似的促進生長的作用及其強弱程度。本研究所選取的20例LSCC標本原代培養未污染的16例,與CAFs分離后LSCC細胞傳代過程中很快凋亡,均在4代以內停止生長,而與CAFs共培養的LSCC細胞在體外的培養活性始終無明顯下降。我們分別從形態學、流式細胞儀凋亡比例檢測及Caspase 3蛋白表達水平檢測進一步進行了研究。

我們首先對分離培養的LSCC原代細胞及CAFs進行了免疫細胞熒光鑒定,發現LSCC細胞為pan-CK陽性,而Vimentin陰性,表明其為上皮來源,與文獻報道的鱗癌免疫染色結果一致[13]。相反,CAFs為pan-CK陰性,而Vimentin陽性,表明其為成纖維細胞來源[14]。此外,根據文獻報道,我們還進一步選取了FAP及α-SMA兩個CAFs特異性蛋白進行染色[15],發現兩種蛋白染色均為陽性,進一步證實了我們所培養LSCC組織中的成纖維細胞的確為CAFs。

我們用相差顯微鏡觀察了LSCC細胞在脫離了CAFs后單獨體外培養傳代時的形態學變化,結果發現:與CAFs分離后單獨培養的LSCC細胞在傳代過程中很快發生凋亡,伴隨著形態學的顯著變化,從之前的鵝卵石樣貼壁生長變得越來越扁平,胞質出現巨大空泡,并且貼壁能力明顯下降,最終漂浮于培養液中。相比之下,一直與CAFs共培養的LSCC細胞在傳代過程中形態學無顯著變化。我們在文獻中尚未見類似的形態學變化報道。

通過流式細胞儀定量檢測了LSCC細胞在體外傳代培養過程中的凋亡細胞比例變化發現:在有CAFs共培養的條件下,LSCC細胞在傳代過程中始終僅檢測到微量凋亡細胞;相比之下,無 CAFs的輔助培養,LSCC細胞在傳代過程中很快凋亡,傳至第3代時,其早期及晚期凋亡細胞的總和已達到近80% (P<0.05)。

最后,我們借助于Western blot對兩種培養條件下的LSCC細胞Caspase 3蛋白表達水平進行了檢測,發現在沒有CAFs輔助培養的條件下,LSCC細胞Caspase 3蛋白表達水平隨傳代而逐代增加;反之,LSCC細胞在傳代過程中Caspase 3表達的表達水平無明顯變化,始終僅檢測到微量表達 (P<0.05)。

綜上所述,我們在前期實驗研究結合文獻報道的基礎之上提出了CAFs對LSCC原代細胞的體外培養具有非常重要的抗凋亡作用的假設,通過實驗設計進一步從形態學到細胞分子生物學水平進行了驗證,證實了這一假設的正確性,在國內外文獻中尚未見類似報道。我們的實驗發現與目前文獻報道的結果存在不同之處。已發表的文獻發現CAFs對腫瘤細胞系起到的作用僅僅是促進部分生長和侵襲轉移能力,而本文得到的結果卻不僅僅是促進部分生長的能力,而是沒有CAFs的輔助培養,脫離了原先腫瘤微環境的原代LSCC細胞無法存活。得出這樣不同結果的原因與我們所用的材料是原代培養的LSCC細胞而不是腫瘤細胞系有關。腫瘤細胞系與原代腫瘤細胞在生物學特性上存在巨大差異,已經建成的腫瘤細胞系幾乎能夠無限傳代而活力不減,因為它們已經經歷了建系的體外培養篩選,然而大多數原代腫瘤細胞在體外培養的傳代過程中增殖活性逐代下降,很快發生凋亡而在建系過程中被淘汰。例如,1973年Giard等[16]報道了200例人腫瘤標本原代培養建系工作,建成腫瘤細胞系13個,總體成功率僅約6.5%。本研究用與文獻報道不同的研究材料——原代培養的腫瘤細胞,得出了與文獻報道不同的研究結論，CAFs對LSCC原代腫瘤細胞適應新環境的生長起到決定性的促進生長作用而不是部分促進作用。我們認為,這樣的結論應該更貼近臨床LSCC患者的腫瘤侵襲轉移生物學特性,為消滅臨床早期轉移灶的靶向治療提供了部分實驗依據。

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Laryngeal cancer associated fibroblasts promote the growth of primarily cultured laryngeal squamous cell carcinoma cellsinvitro

WANG Mei1,2▲,WU Chun-ping3▲,CAO Xiao-juan4,ZHENG Wen-wei4,FAN Guo-kang1△

(1DepartmentofOtolaryngology,SecondAffiliatedHospital,SchoolofMedicine,ZhejiangUniversity,Hangzhou310009,ZhejiangProvince,China;2DepatmentofOtolaryngology,ShanghaiMunicipalHospitalofTraditionalChineseMedicine,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai200071,China;3DepartmentofHeadandNeckSurgery,EyeandENTHospital,FudanUniversity,Shanghai200031,China;4DepartmentofOtolaryngology,SecondAffiliatedHospital,JiaxingUniversityCollegeofMedicine,Jiaxing314000,ZhejiangProvince,China)

【Abstract】ObjectiveTo explore whether the laryngeal cancer associated fibroblasts (CAFs) can promote the growth of primarily cultured laryngeal squamous cell carcinoma (LSCC) cells in vitro.MethodsTwenty LSCC specimens were collected and primarily cultured.The LSCC cells growing out of the seeded tissue fragments were separated from the CAFs by differential trypsinization and subcultured continually.The inverted phase-contrast microscope was used to observe the morphological change of the cultured LSCC cells,flow cytometry was used to quantify the proportion of Apoptotic cells,and Western blot was used to detect the protein level of Caspase 3.The LSCC cells cocultured with CAFs consistently serverd as controls.ResultsFor the LSCC cells separated from CAFs,proliferation capacity decreased rapidly in the passage culture in vitro,and the most cells were terminated within the 3 generations.The apoptotic and floating LSCC cells observed by the phase-contrast microscope,the percentage of apoptotic cells quantified by the flow cytometry,and the protein level of Caspase 3 detected by Western blot increased gradually.By contrast,no significant differences of proliferation capacity of the LSCC cells cocultured with CAFs were detected during the in vitro subculture system (P<0.05).ConclusionsThe laryngeal CAFs can promote the growth of primarily cultured LSCC cells in vitro.

【Key words】cancer associated fibroblasts;laryngeal squamous cell carcinoma;primary culture;apoptosis

(收稿日期:2015-07-24;編輯:沈玲)

【中圖分類號】R739.65

【文獻標識碼】A

doi:10.3969/j.issn.1672-8467.2016.02.009

▲Co-first authors

△Corresponding authorE-mail:fanguokang@163.com