體內(nèi)和細(xì)胞內(nèi)的活性物種的測(cè)定方法

李菲

自由基和其他活性O(shè)、N、Cl粒子，被廣泛認(rèn)為對(duì)于許多與年齡有關(guān)的病的發(fā)展有作用。或者，它甚至可以通過(guò)氧化和氧化損害對(duì)老化過(guò)程本身起作用。許多研究已經(jīng)顯示，對(duì)于老年癡呆癥病人腦中所有主要種類生物分子的不斷增加的氧化損害，其他氧化損害牽涉到的疾病，包括癌癥、動(dòng)脈硬化癥以及其他神經(jīng)退化疾病和糖尿病。在這篇報(bào)道中，我們將調(diào)查測(cè)定活性物種的可行性方法，并特別強(qiáng)調(diào)對(duì)人類研究的應(yīng)用。

許多誘人的技術(shù)，例如，L-譜帶具有硝酰探針的電子自旋共振成像自旋陷阻，在所有動(dòng)物中直接測(cè)定活性物種還有待發(fā)展。但是目前為止，還沒(méi)有探針適合人類使用。大部分活性物種在體內(nèi)僅僅持續(xù)很短的時(shí)間，并且無(wú)法直接測(cè)定。有幾個(gè)例外：包括H2O2（下面將討論），或者還有NO。在某種意義上NO2-漿液水平已經(jīng)被要求脈管合成。

基本上有兩種方法來(lái)檢測(cè)短暫的活性物種：

●嘗試去阻止這些物種并測(cè)定這些被阻物種的水平。

●測(cè)定由活性物種引起的損害的水平，那就是說(shuō)，氧化損害的量。

有些時(shí)候，也會(huì)用其他的方法。他們包括測(cè)定紅血球抗氧化損害和所有抗氧化物在體內(nèi)的流動(dòng)活性，這些參數(shù)的降低常常作為氧化脅迫的證明。紅血球不能合成蛋白質(zhì)。然而，他們的抗氧化酶的水平隨著他們?cè)谘h(huán)中的老化也會(huì)下降。因此，他們含量的變化更能夠反映出血液中紅細(xì)胞在更新中的變化。如果這個(gè)變慢了，循環(huán)的紅血球?qū)⒃谄骄缴献兝匣⑶铱寡趸杆揭矊⒈憩F(xiàn)出降低趨勢(shì)。反之亦然，如果一種變化加速了血紅細(xì)胞的消除或者是增加了紅細(xì)胞生成素，紅細(xì)胞中抗氧化成分的水平將上升。然而，這樣的數(shù)據(jù)應(yīng)該謹(jǐn)慎闡述。

介于用于測(cè)定它的方法，盡管不同的方法測(cè)定不同的物種，血漿或血清的總體抗氧化能力通常包括來(lái)自尿酸和白蛋白的主要貢獻(xiàn)。因此，例如，如果血漿白蛋白的水平下降了，TAC將降低，如果尿酸水平上升了，TAC將上升。血液中化學(xué)的多重變化發(fā)生在病人身上就意味著TAC變化謹(jǐn)慎說(shuō)明了。TAC也同樣會(huì)受飲食影響，通常因?yàn)槟呈澄锏南目赡軙?huì)在血漿中或尿酸水平上產(chǎn)生變化。

唯一的能直接和詳細(xì)地“看見(jiàn)”自由基的技術(shù)是電子自旋共振，因?yàn)樗軝z測(cè)出未成對(duì)電子的存在。然而，ESR僅能檢測(cè)相對(duì)不太活潑的原子團(tuán)。因?yàn)榛顫姷脑訄F(tuán)不能積累到一個(gè)足夠高的水平上來(lái)被測(cè)定。解決這個(gè)問(wèn)題的一個(gè)方法是增加陷阻或探針，來(lái)攔截自由基，同它們反應(yīng)來(lái)形成一個(gè)穩(wěn)定的基團(tuán)，它能夠被ESR檢測(cè)到。全身ESR技術(shù)用于動(dòng)物身上，但是現(xiàn)在由于缺少關(guān)于探針在人體上的安全數(shù)據(jù)，因此，現(xiàn)在無(wú)法應(yīng)用于人類。很廣范圍的陷阻是可以用于動(dòng)物和細(xì)胞組織的，不僅僅是試驗(yàn)過(guò)和測(cè)試過(guò)的N-叔丁基-α苯基硝酸靈和5，5-二甲基-1-吡咯啉，N-氧化物，還有像1，1，3-三甲基-異吲哚，N-氧化物，DECPO，EPPN，DEPMPO，BMPO之類相對(duì)的新物質(zhì)。潛在的問(wèn)題由Rosen以及其他人綜述概括了。一個(gè)通常未得到正確評(píng)價(jià)的問(wèn)題是反應(yīng)產(chǎn)品給予ESR的信號(hào)能迅速的在體內(nèi)和培養(yǎng)的細(xì)胞中消除，通過(guò)酶代謝或直接由VC等物質(zhì)降低。例如，當(dāng)DMPO用于阻止OH-時(shí)，任何抗壞血酸鹽的出現(xiàn)都能夠直接減少DMPO-OH-加合物的量到ESR檢測(cè)不到的水平。許多文獻(xiàn)已經(jīng)提出了多種復(fù)合物抗氧化反應(yīng)的例證，在基團(tuán)產(chǎn)生體系的存在下，當(dāng)化合物同DMPO或其他自旋陷阱加合時(shí)，通過(guò)測(cè)定ESR信號(hào)的減少這個(gè)結(jié)果在體外評(píng)定出的。這些文獻(xiàn)很少報(bào)道關(guān)鍵控制：增加的復(fù)合物是否會(huì)與產(chǎn)生原子團(tuán)的系統(tǒng)發(fā)生沖突，分解H2O2或與Fe2+/H2O2鰲合，或者它是否直接與自旋陷阻加合物反應(yīng)，把它降低到ESR檢測(cè)不到的物種。

Rizzi及其他人已經(jīng)引進(jìn)了三甲基自由基，TAMOXO63，在含水條件下作為探測(cè)O2-的探針。在這種情況下，O2-同探針?lè)磻?yīng)導(dǎo)致了ESR信號(hào)的丟失。TAMOXO63的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是它不受如Vc或降谷胱甘肽這類物質(zhì)降低的控制。

探測(cè)器的寬系列可以用來(lái)研究許多細(xì)胞項(xiàng)目，比如說(shuō)pH變化，離子運(yùn)動(dòng)、識(shí)別各種各樣的細(xì)胞器。例如CCA的增多往往伴隨著氧化脅迫的提高。許多報(bào)紙雜志稱RS的產(chǎn)生可影響離子探針，或者離子探針對(duì)RS的形成有貢獻(xiàn)。比如說(shuō)鈣黃綠素[69]線粒體追蹤器，一種用來(lái)鑒定線粒體的熒光探針，能刺激線粒體ROS的產(chǎn)生。

不管你用什么方法來(lái)追蹤活性物種或測(cè)定氧化性損傷，都必須考慮以下幾個(gè)方面：這個(gè)方法怎么操作，怎樣合成和它能達(dá)到什么樣的規(guī)模、數(shù)量。充分理解了這幾點(diǎn)，錯(cuò)誤可以降低到最少并且自由基研究的活力領(lǐng)域可以繼續(xù)向前推進(jìn)。

編輯 董慧紅