盲腸結扎穿孔敗血癥小鼠模型的手術方式優化*

郭佳南　劉文鈺　周東　田林郁

(四川大學華西醫院神經內科，四川 成都　610041)

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盲腸結扎穿孔敗血癥小鼠模型的手術方式優化*

郭佳南劉文鈺周東田林郁△

(四川大學華西醫院神經內科，四川 成都610041)

摘要目的：探究如何對傳統盲腸穿孔結扎(Cecal ligation-and-perforation，CLP)敗血癥模型手術方式進行優化。方法：選取雄性昆明小鼠103只按是否給予亞胺培南/西司他丁分為：抗生素組、無抗生素組和假手術組。在傳統CLP手術方式的基礎上縮小手術切口，調整切口位置和術后抗生素用量來觀察接受手術小鼠術后存活率及不同批次間小鼠存活率一致性等指標，并與既往文獻報道的同類模型進行比較。結果：在本次實驗103只小鼠手術中，抗生素組、無抗生素組和假手術組三組小鼠存活時間的分布總體有差異(P=0.026)。組間兩兩比較發現：抗生素組與無抗生素組7天生存率明顯高于無抗生素組(P<0.001)，假手術組生存率明顯高于無抗生素組生存率(P<0.001)，而抗生素組與假手術組存活率差異無統計學意義(P=0.331)。抗生素組10個批次小鼠存活率的Cronbach’s α系數為0.954。結論：優化后的CLP小鼠模型存活率與傳統模型相似，具更亦操作的標準化的手術流程，切口更小，組間生存率一致性高，可重復性好。

關鍵詞：敗血癥；動物模型；手術方式；盲腸結扎穿孔；生存率

敗血癥是ICU患者高發的疾病，也是ICU患者常見的死因。在中國大陸的一項多中心的隊列研究顯示，ICU患者被診斷重度敗血癥或感染性休克的比例為37.3%，在ICU住院期間死亡率高達28.7%[1]，而在世界范圍內的敗血癥總死亡率在30%到70%不等，平均死亡率約在50%[2]。而因創傷入院的患者中有近一半的患者合并敗血癥[3]。即使救治及時使患者度過危險期，仍然有許多遠期并發癥，如免疫抑制狀態和肺部損傷[3]等。另外，敗血癥也是很多發展中國家的兒童的主要死亡原因之一[4]。因此，對敗血癥的基礎研究至關重要。

盲腸結扎穿孔動物模型(Cecal ligation and puncture，CLP)被認為是目前多種敗血癥動物模型的金標準。因為它破環了生物的自然屏障從而誘發敗血癥，因此可較準確地從自然病程和病因上模擬人類的敗血癥[3]。另外，CLP敗血癥模型建立后的血流動力學也與人類敗血癥的血流動力學十分相似[5]。目前的CLP敗血癥動物模型可在小鼠、大鼠等多種動物上建立。本實驗以小鼠為模型動物對傳統CLP敗血癥小鼠的手術方式稍作優化后觀察術后小鼠在不同時段的存活率并據此推測模型的穩定性。

1材料與方法

1.1材料

選取103只體重為20-25 g清潔級昆明雄性小鼠(成都達碩生物有限公司提供)。飼養環境：10只/籠，24℃恒溫、恒濕飼養；采用12 h光-暗周期、飼料及飲水均經紫外光照滅菌后供應，術前及術后均充足供應食物及水。為了更好擬合天然屏障被破壞后感染引起敗血癥的真實情況，小鼠術前不禁食；并據傳統CLP小鼠模型[5]的手術方法并進行一定改造后手術，改造部分詳見表1。

1.2方法

1.2.1手術

手術分組：103只小鼠共分10批完成手術：第一至七批每批10只，第八至十批每批11只。每批次手術小鼠中，隨機選取1只作為假手術組，即麻醉后僅開腹后尋找盲腸后還納，關腹。剩余小鼠術后隨機分為抗生素組和無抗生素組2組。2組均接受CLP手術。本次實驗共取103只小鼠手術，分10個批次手術，每批10或11只小鼠，全部手術均由相同的2名操作者協作完成，不同批次的手術均在手術當天的同一時間段內完成。其中抗生素組72只，無抗生素組22只，假手術組9只(最后1批次手術未設假手術組)。

表1　CLP動物模型改造之處

1.2.2手術步驟

麻醉：用膠帶將小鼠四肢及尾部固定于無菌手術臺上，使用新鮮配置的3.5%水合氯醛溶液0.1 ml·10g-1體重進行腹腔注射麻醉。為避免干擾手術，腹腔注射麻醉均選擇小鼠右下腹進針。注射后約10 min用鑷子夾小鼠足趾，驗證小鼠疼痛反應下降滿意后開始手術。

開腹：備皮后使用5%聚維酮碘溶液消毒整個腹部皮膚，用剪刀在劍突下中線偏左3-5 mm開已平行于中線的長約0.5-1.0 cm縱行切口，逐層剪開至打開腹膜暴露腸管。

結扎：用小號平鑷輕輕提起盲腸，找到盲腸游離末端輕提使之與其余腸管分離。用4-0絲線在距盲腸末端約1 cm處結扎盲腸，注意避免結扎或損傷腸系膜血管。

穿孔：使用22G針頭在被結扎的盲腸中點處穿孔，針頭需穿通全層腸壁并由另一側穿出。使用平鑷輕夾腸管至擠壓出少量腸內容物，約與穿刺針孔大小相當，后還納腸管至腹腔。消毒局部切口切緣后使用4-0絲線逐層關腹。

關腹后再次使用5%聚維酮碘溶液消毒切口處，并以右下腹為進針點腹腔注射0.5ml無菌生理鹽水補液，見圖1。

將術后小鼠放回已滅菌的鼠籠，并隨機分為2組：抗生素組和無抗生素組?？股亟M術后3 h后給第一劑抗生素，抗生素采用亞胺培南/西司他丁(Imipenem/cilastatin，Tienam; Merck Sharp & Dohme Ltda)333.33 mg·kg-1。無抗生素組同時接受等量無菌生理鹽水腹腔注射。以后每12 h按組別給抗生素或生理鹽水一次，至小鼠死亡或給藥滿3天。假手術組小鼠術后立即腹腔注射一劑亞胺培南/西司他丁，333.33 mg·kg-1預防切口感染。隨后3天與無抗生素組小鼠同等處理。

1.2.3觀察指標

觀察各組小鼠術后的活動、進食進水狀況、切口生長情況，記錄小鼠術后24 h至術后7 d每天的存活率。

圖1　手術方法示意圖A手術切口；B找到盲腸后據盲端約1 cm處結扎；C用平鑷輕擠出少量腸內容物；D將盲腸還納腹腔，逐層關腹

1.3統計學分析

利用軟件SPSS13.0進行統計分析，采用壽命表法(Life-table method)進行生存分析，使用Wilcoxon法來對三組小鼠的生存時間的分布進行整體比較。繪制生存曲線并對接受標準手術及抗生素治療的不同批次的小鼠生存率采用Cronbach’s α系數法進行信度評價。P<0.05被認為是結果具有統計學差異。Cronbach’s α系數>0.7被認為信度較高。

2結果

在完成手術后觀察并記錄術后24 h、48 h、72 h、及術后7 d小鼠的切口情況、活動狀況及存活率。

本次實驗接受手術的小鼠在術后麻醉蘇醒后活動較多，僅較術前稍減少。但術后第6-24 h明顯有進食、飲水及活動的減少。切口在1 cm內，在術后7 d的觀察期內包括無抗生素組小鼠的所有觀察對象在死亡前或觀察期結束前均不合并局部切口感染。

截止隨訪的時點，各組不同時間點的存活率詳見表2。

表2　各組不同時間點的存活率(%)

注：與假手術組相比，*P<0.001。

使用采用壽命表法(Life-table method)進行生存分析后生存曲線如圖2，使用wilcoxon法來對三組小鼠的生存時間的分布進行整體比較后發現，三組小鼠存活時間的分布總體有差異(P=0.026)。經組間兩兩比較后發現，抗生素組生存率高于無抗生素組(P<0.001)，假手術組生存率高于無抗生素組生存率(P<0.001)，而抗生素組與假手術組存活率差異無統計學意義(P=0.331)。

在第一、二批接受手術的21只小鼠中，觀察至術后第8周。至術后第8周，抗生素組存活10只，存活率為76.9%(10/13)，而無抗生素組存活率：12.5%(1/8)。8周后總存活率為52.3%(11/21)。

圖2　三組小鼠生存曲線

在10個批次接受標準化手術及抗生素治療的72只小鼠中，分別統計術后1-7天的存活率，得到Cronbach’s α系數為0.954。

3討論

敗血癥是ICU中發病率高，死亡率高的疾病。當下醫學對敗血癥的治療仍然與三十年前的治療方式相同[7]。因此，雖然敗血癥是一種古老的疾病，但對它的發病機理與治療的研究卻并不過時。目前仍有多種敗血癥動物模型用于敗血癥的基礎研究，包括三種機制：1、外源性毒素入血，如：內毒素模型(Endotoxin model)；2、外源性病原體入血，如：活菌模型(Live bacteria model)；3、天然屏障破壞，如盲腸結扎穿孔模型(Cecal ligation-and-perforation model)等[7]。

良好的敗血癥小鼠模型應具備以下特性：標準化(Standardization),可重復性(Reproducibility), 以及多用途(Versatility)等特性[8]。盲腸結扎穿孔(CLP)模型因其發病機制與人類敗血癥的自然發病機制相似而被認為是各類敗血癥動物模型中的“金標準”。CLP之所以被廣泛應用主要由于其多功能性：可以合并創傷、失血等因素進行研究，亦可在其他疾病動物模型的基礎上進行建立。但因CLP手術方式難以標準化、死亡率受穿孔針大小影響較大而被認為穩定性較差。因此，基于現狀優化CLP動物模型的標準化流程及可重復性十分重要。本實驗旨在探究如何優化CLP敗血癥模型的手術方式及術后支持治療使模型具有更易標準化且可重復性好的建立流程。

3.1手術方式的標準化

本項實驗采取了傳統CLP手術步驟，對于針孔大小、穿孔數及穿孔位置這三項已被證實決定最終死亡率的指標進行了標準化[9]。在Toscano M等人的報道中采用了22號針頭在據盲腸末端1 cm處結扎，并于結扎部位中點穿孔2次[5]。本項實驗通過改變切口位置至劍突下中線偏左3-5 mm使手術視野更于對盲腸進行操作，從而縮小了手術切口。本次實驗接受手術的小鼠切口在1 cm內，在術后7 d的觀察期內包括無抗生素組小鼠的所有觀察對象在死亡前或觀察期結束前均不合并局部切口感染。

3.1.1手術切口的縮小

傳統小鼠的CLP手術往往采用1-2 cm[5,6]甚至超過2 cm的劍突下中線切口來完成手術，對于體重較小或月齡較小的小鼠是一個較大的打擊，而且切口大，術后局部切口感染的風險較高，不利于敗血癥小鼠的長期觀察。Katharina Sommer等人曾對CLP小鼠模型的切口愈合狀況進行了研究，發現在敗血癥狀態下，傷口愈合能力下降，不僅使CLP手術術后傷口愈合時間延長，而且會影響遠處傷口的愈合[10]。因此，在敗血癥的動物模型中縮小手術切口可能會降低術后切口局部的感染風險，避免切口感染給動物敗血癥的觀測帶來干擾。本次實驗接受手術的小鼠切口在1 cm內，在術后7 d的觀察期內包括無抗生素組小鼠的所有觀察對象在死亡前或觀察期結束前均不合并局部切口感染。因此，適當減小手術切口是必要的，尤其對于觀察期長，因免疫功能不全等因素而切口感染風險高的實驗十分重要。

3.1.2抗生素的運用

本實驗選擇廣譜抗生素亞胺培南/西司他丁，并加大劑量進行治療可以使發病后的實驗小鼠長期存活，但并不會降低革蘭陰性菌產生的內毒素對機體的打擊，利于長期觀察和對重癥感染后遺的免疫功能抑制、認知功能障礙等等疾病進行探究。早在1997年，Wickel DJ等人通過對連續105例因腹膜炎繼發敗血癥的患者研究發現，臨床中因腹膜炎繼發敗血癥的患者死亡率直接與快速進展的多器官衰竭相關，而非直接與腹膜炎的感染復發相關[11]。Gonnert FA等人研究發現，在腹膜炎繼發敗血癥的動物模型中，雖然抗生素可以提高實驗動物的存活率，但存活動物的血清學炎癥反應指標及肝臟、腎臟的活檢均提示炎癥反應持續存在[12]。因此，抗生素的運用并不會掩蓋感染所致的炎癥反應打擊，但抗生素可使實驗動物長期存活以便觀察，而持續存在的炎癥反應損傷又可供探究敗血癥患者痊愈后認知功能障礙、免疫抑制的原因等等。同時，廣譜抗生素也是目前重癥感染的常用治療藥物，這對模擬人類敗血癥的治療后的臨床情境相符合。

3.2模型可重復性的評價

在10個不同批次接受標準化手術方案并輔以抗生素治療的72只小鼠中，以Cronbach’s α系數法進行信度評價，比較不同批次間小鼠存活率的可重復性，得到Cronbach’s α系數為0.954，大于0.7，說明不同批次間小鼠在不同術后時點生存率的可重復性較高，模型在生存率上的內部一致性較好。

3.3局限性分析

優化后的CLP敗血癥模型也存在一些缺點：首先，評價模型是否成功建立的指標比較局限。雖然CLP敗血癥模型可在多種動物中建立，其中嚙齒動物模型因其建立成本較其他動物低，在基礎研究中應用十分廣泛。但嚙齒動物血量少，在模型建立初期取血往往對動物存活是致命的，會對模型的最終死亡率產生干擾，因此通過血培養或檢測急性期炎癥因子水平去驗證模型成功率往往難以實現[3]，這一點難以擬合臨床敗血癥的診斷流程。所以，通過統計未用藥物或手術干預狀態下CLP術后動物的最終死亡率來提示模型感染和炎癥反應嚴重度[13]。另外，術后3 h用抗生素，這一時間間隔往往不同于臨床真實患者從發病到接受治療的時間，因此抗生素輔助治療的效果難以擬合真實的臨床環境。

優化后的CLP小鼠模型在無抗生素治療情況下一周的死亡率達86.36%，感染屬于中至重度，輔以廣譜抗生素單藥治療后可長期存活，切口小，術后局部感染率大大降低。該模型在大樣本量的小鼠中可重復性好，可用于對敗血癥后長期預后的研究與觀察。

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An improved mice model of cecal ligation and perforation for sepsis*

Guo Jia-nan, Liu Wen-yu, Zhou Dong, Tian Lin-yu△

(Department of Neurology, West China Hospital of Sichuan University, Sichuan Chengdu 610041)

AbstractObjective：To explore how to improve traditional Cecal-ligation and puncture(CLP) procedure. Methods: A total of 103 KM male mice were randomly divided into three groups: antibiotic group, no antibiotic group and sham group. Antibiotic group were treated with imipenem and cilastatin; for sham group, we only open the peritoneum and then closed without therapeutic use of antibiotics. We designed a shorter incision in a new site below xiphoid, changing the dose of antibiotics after surgery and observe the survival rate after surgery. Results: Generally, among all 103 mice accepted the surgery, the survival rate of antibiotic group, no antibiotic group and sham group were with statistically difference(P=0.026). Comparison between each groups showed that: the seven days postoperative survival rate was higher in antibiotic group and no antibiotic group(P<0.001); survival rate in sham group was higher than that in no antibiotic group(P<0.001). However, the survival rate between antibiotic group and sham group has no difference(P=0.331). Cronbach’s α coefficient among 10 batches’s survival rate in antibiotic group is 0.954. Conclusion: Compared with traditional CLP one, improved model has a similar survival rate and a easy standard surgical procedure with smaller incision and a reliable result.

Key Words:Sepsis; Animal model; Surgery procedure; Cecal ligation-and-perforation; Survival rate

(收稿日期：2015-12-22)

作者簡介：郭佳南，女，八年制博士在讀，主要從事神經病學研究工作，Email：875641285@qq.com。△通訊作者：田林郁，女，副教授，主要從事神經重癥醫學臨床研究工作，Email：tianlinyu@sina.com。

*基金項目：國家自然科學基金青年科學基金項目(編號：81301659)