Sirt1轉基因小鼠股動脈結扎后血管新生的初步研究

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Sirt1轉基因小鼠股動脈結扎后血管新生的初步研究

李曉坤，麻曉婷，聶磊，竇永青，韓梅*(河北醫科大學基礎醫學院生物化學與分子生物學教研室，河北 石家莊 050017)

[關鍵詞]新生血管化,生理性；股動脈；小鼠

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2016.03.026

血管新生是在血管新生因子刺激下，已存在的血管通過內皮細胞遷移、增殖形成新血管的過程[1-3]。生理情況下，血管新生可以為組織提供更多血流，而當其調節紊亂時會發生血管新生異常，包括血管新生過度或血管生成不足，進而造成多種疾病，如惡性腫瘤、糖尿病視網膜病變、動脈粥樣硬化、缺血性心臟病、風濕性關節炎等。因此，研究血管新生性疾病的治療靶點具有重要意義。沉默信息調節因子1(silent information regulator 1,SIRT1)是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴的去乙酰化酶[4-5]，對調節衰老、細胞存活、代謝和炎癥、腫瘤形成等起重要作用，有研究報道SIRT1在血管新生中起關鍵調節作用[6]。本研究利用野生型(wild type,WT)C57BL/6及Sirt1轉基因(Sirt1-Transgenic，Sirt1-Tg)小鼠建立下肢股動脈結扎手術模型，對組織缺血后血管新生情況進行初步研究。

1材料與方法

1.1實驗動物C57BL/6小鼠由河北省實驗動物中心提供，Sirt1-Tg小鼠由中國協和醫科大學劉德培教授惠贈，本實驗室自行繁殖培育。所有動物均飼養于無特定病原體(specefic pathogen free,SPF)級動物房，溫度濕度恒定的獨立通氣籠盒，清潔飲水，自由取食。環境采用12 h明暗循環，早7：00到晚7：00照明，晚7：00到次日早7：00無照明。所有動物實驗均按照河北醫科大學動物管理條例進行。

1.2Sirt1-Tg小鼠基因型鑒定隨機選取6～8周齡Sirt1-Tg小鼠，按照雌雄比例為2∶1的方式交配[7]，自由飲水取食，孕鼠自然分娩。仔鼠出生3周后斷奶，雌雄分籠，取鼠耳基因組DNA，用聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)技術進行基因型鑒定。引物序列如下：上游引物 5′-CTTCAGGTCAAGGGATGGTAT-3′，下游引物 5′-GCGTGTCTATGTTCTGGGTAT-3′。PCR擴增產物長度為233 bp。PCR反應條件為：94 ℃ 5 min，94 ℃ 20 s、53 ℃ 20 s、72 ℃ 30 s(30個循環)，72 ℃ 10 min。對PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳并觀察結果。

1.3左下肢股動脈結扎小鼠模型建立隨機挑選8周齡的成年雄性C57BL/6(WT)小鼠及Sirt1-Tg小鼠各10只，手術全程在小動物麻醉機下進行，采用異氟烷持續吸入麻醉方式麻醉小鼠，取俯臥位，用透明膠帶將小鼠四肢固定于手術板上，在固定條件(室溫24 ℃、無強光、無噪聲)下采用血流測量儀PeriCam PSI測量術前雙下肢血流灌注情況并采用激光散斑對比分析技術記錄圖像。仰臥位下，常規褪毛備皮，75%酒精消毒左下肢側，用眼科鑷提起皮膚，用剪刀從左側腹股溝到左大腿內側沿血管走行方向縱行剪開一長1～1.5 cm的切口。在解剖顯微鏡視野下，用眼科鑷鈍性分離皮下組織，刺破膜狀血管鞘，充分暴露股動脈、股靜脈及其分支和股神經。輕輕分離股神經使其游離，然后將股動脈與股靜脈分離，用彎頭眼科鑷剝離股動脈至股動脈分支處，防止損傷血管，用2根7號手術縫線穿過股動脈進行雙端結扎，上端緊靠股動脈分支，下端距上端約5 mm，剪斷兩結扎點間的股動脈[8]，縫合皮膚。再次用血流測量儀PeriCam PSI測量俯臥位時小鼠雙下肢血流灌注情況，結扎側無血流灌注即為模型建造成功。分別于術后3、7、14 d進行血流監測分析。

2結果

2.1小鼠基因型鑒定瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，Sirt1-Tg小鼠PCR產物在250 bp附近可見清晰的條帶，WT小鼠無此條帶(圖1)。

2.2血流監測激光散斑對比分析技術血流監測顯示，結扎術前，Sirt1-Tg小鼠及WT小鼠雙下肢血流灌注信號分布均一(圖2 A,B)；左下肢股動脈結扎后，該側肢體血流灌注信號明顯減弱甚至消失(圖2 C,D)；結扎術后3 d，左下肢顯示局部微弱的血流灌注信號(圖2 E,F)；結扎術后7 d(圖2 G,H)、14 d(圖2 I,J)Sirt1-Tg小鼠及WT小鼠左下肢血流灌注均有所恢復，但Sirt1-Tg小鼠左下肢血流灌注恢復情況明顯較WT小鼠差。

圖1Sirt1-Tg小鼠基因型鑒定

M.Marker；WT.野生型C57BL/6小鼠；1～6.Sirt1-Tg小鼠

圖2股動脈結扎術后2組小鼠下肢血流變化示意圖

*為小鼠左下肢，未標示側為小鼠右下肢。血流信號圖像對應不同的顏色：紅色表示最大血流灌注量，藍色(或深藍色)相反，黃色介于兩者之間

A.結扎術前WT小鼠;B.結扎術前Sirt1-Tg小鼠;C.術后即刻WT小鼠;D.術后即刻Sirt1-Tg小鼠;E.術后3 d WT小鼠;F.術后3 dSirt1-Tg小鼠;G.術后7 d WT小鼠;H.術后7 dSirt1-Tg小鼠;I.術后14 d WT小鼠;J.術后14 dSirt1-Tg小鼠

3討論

新生血管性疾病，無論是血管生成過度或是血管生成不足均同人類健康和疾病的發生有著密切的關系，如血管新生過度參與腫瘤的發生發展和轉移，血管新生不足則會引起各種缺血性疾病。SIRT1在應激反應、代謝、衰老、腫瘤發生發展等多個生理病理過程中發揮重要作用[9]，有研究顯示SIRT1在腫瘤血管新生中發揮負調節作用[10]。本研究結果顯示Sirt1-Tg小鼠在股動脈結扎后血流灌注恢復差。提示血管新生受到抑制，但其具體的影響機制尚須進一步探索。缺血缺氧狀態下低氧誘導因子1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)[11]對血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)影響最大，VEGF具有促血管內皮細胞生長和分化功能的作用[12]，能夠促進血管新生[13]。有研究報道，SIRT1通過下調HIF-1α表達而抑制VEGF的轉錄活性及蛋白表達，從而抑制血管新生[14]。也有研究顯示在缺氧環境下，SIRT1通過使HIF-1α發生脫乙酰作用而失活[10]。這些為后續研究提供了一定的思路。

本實驗的創新點在于引入了Sirt1-Tg小鼠制作組織缺血-血管新生模型。初步結果提示，SIRT1可能對血管新生過程具有抑制作用，該發現對理解腫瘤生長調節和缺血性損傷修復機制提供了新的觀點。

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(本文編輯：趙麗潔)

[中圖分類號]R331.3

[文獻標志碼]B

[文章編號]1007-3205(2016)03-0340-03

[作者簡介]李曉坤(1991-)，女，河北平山人，河北醫科大學基礎醫學院醫學碩士研究生，從事血管生物學研究。*通訊作者。E-mail：hanmei@hebmu.edu.cn

[基金項目]國家自然科學基金(91439114，31471092，31271222)

[收稿日期]2015-12-23；[修回日期]2016-02-01