酒石酸美托洛爾連續給藥大鼠體內藥動學研究

張亞坤，王偉美，貢　瑩，張　歡，張志清(河北醫科大學第二醫院藥學部，河北 石家莊 050000)

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·論著·

酒石酸美托洛爾連續給藥大鼠體內藥動學研究

張亞坤，王偉美，貢瑩，張歡，張志清*(河北醫科大學第二醫院藥學部，河北 石家莊 050000)

[摘要]目的觀察連續服用酒石酸美托洛爾(metoprolol tartrate,MT)片6 d后大鼠體內藥動學變化。方法將40只大鼠隨機分為2組各20只。實驗組灌胃酒石酸MT 27 mg/kg 每天1次，連續6 d；對照組灌胃等量蒸餾水每天1次，連續6 d。2組于第7天同時灌胃酒石酸MT(27 mg/kg)后5 h內眼內眥取血，血漿樣品處理后用超高效液相色譜法(ultra performance liquid chromatography，UPLC)測定并繪制藥時曲線，并用DAS 2.1.1 軟件擬合藥動學參數，采用SPSS 13.1軟件對2組藥動學參數進行統計學分析。結果實驗組與對照組主要藥動學參數：血藥濃度時間曲線下面積(area under curve，AUC)(0～5 h)分別為(0.84±0.40) mg·h(-1)·L(-1)和(0.96±0.46) mg·h(-1)·L(-1)；AUC(0～∞)分別為(0.91±0.41) mg·h(-1)·L(-1)和(1.05±0.50) mg·h(-1)·L(-1)；藥物消除半衰期(half life,t(1/2))分別為(1.23±0.36) h和 (1.42±0.41) h；達峰時間(T(max))分別為(0.51±0.10) h和(0.85±0.28) h；表觀分布容積(V)分別為(58.19±22.61) L/kg和(61.54±30.55) L/kg；血漿清除率(plasma clearance,CL)分別為(33.94±13.59) L·h(-1)·kg(-1)和(30.07±11.20) L·h(-1)·kg(-1)；血藥峰濃度(peak concentration,C(max))分別為(0.71±0.40) mg/L和(0.64±0.35) mg/L。2組間T(max)和C(max)差異有統計學意義，其他藥動學參數AUC(0～5 h)、AUC(0～∞)、t(1/2)、CL、V差異無統計學意義(P>0.05)。結論連續灌胃酒石酸MT片6 d后，其在大鼠體內未見蓄積且達峰時間縮短。

[關鍵詞]美托洛爾；藥代動力學；超高效液相色譜法；大鼠

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2016.03.016

美托洛爾(metoprolol tartrate,MT)是心臟選擇性β受體阻滯劑，缺乏內在擬交感活性，有較弱的或沒有膜穩定活性[1]。臨床上用于治療高血壓、心絞痛、心律失常、心肌梗死和心力衰竭，也用于甲狀腺功能亢進癥的治療和偏頭疼的預防[2-7]。酒石酸MT作為臨床常用藥物，用于治療高血壓、心絞痛等心血管疾病時通常需要長期或者終身服用。近年來對酒石酸MT基因多態性方面的研究較多[8-14]，而對其長期治療后的心血管效應及長期服用在藥代動力學方面的研究較少。本研究通過比較服用酒石酸MT6 d前后大鼠體內藥代動力學的變化，旨在為酒石酸MT長期服用的心血管效應提供有力的依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器ACQUITY UPLC?BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm，美國Waters公司)；Waters Acquity UPLC 系統，包括四元梯度泵、恒溫自動進樣器、柱溫箱、紫外檢測器和Waters Empower 3 軟件操作平臺(美國Waters公司)；渦旋混合器(XW-80A，上海醫科大學儀器廠)；冷凍離心機(GL-20G-Ⅱ，上海安亭科學儀器廠)；低溫冰箱(MDF-U2086S，日本SANYO)；數控恒溫水浴氮吹儀(KL512J，北京康林科技有限公司)；抽濾泵(天津市協同儀器有限公司)；電子分析天平(CPA225D，德國Sartorius)；電子天平(HZF-B1200/0.1 g，美國華志)；超聲波清洗器(KQ-300B，昆山市超聲儀器有限公司)；臺式酸度計(哈納pH 213，羅馬尼亞)。

1.1.2藥品與試劑酒石酸MT對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號100084-201403)；拉莫三嗪對照品(內標，中國藥品生物制品檢定所，批號100775-200401)；酒石酸MT片(阿斯利康制藥有限公司，規格25 mg，批號1409028)；磷酸二氫鉀(分析純，北京市紅星化工廠，批號970225-1)；磷酸(分析純，天津市永大化學試劑開發中心出品，批號20041122)；乙酸乙酯(分析純，天津市永大化學試劑開發中心出品，批號20041202)；甲醇(質譜純，賽默飛世爾科技有限公司，批號130701)；高純氮氣(含量99.9%，石家莊京聯實用氣體有限公司，批號20141124)；蒸餾水(深圳屈臣氏蒸餾水有限公司)。

1.1.3實驗動物健康Wistar大鼠，清潔級，雄性，體質量(200±20)g，河北省動物實驗中心提供，動物許可證編號：SCXK(冀)2014-12-009。

1.2實驗方法

1.2.1色譜條件色譜柱：ACQUITY UPLC?BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流動相：甲醇-0.01 mol/L磷酸二氫鉀緩沖鹽(磷酸調節pH 3.6)(31∶69，V/V)；流速：0.36 mL/min ；檢測波長：225 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：2 μL；內標：拉莫三嗪。

1.2.2血漿樣品處理取血漿樣品0.2 mL于1.5 mL離心管中，加入內標溶液(2.50 mg/L液)20 μL混勻，加入提取劑乙酸乙酯1 mL，渦旋振蕩1 min，離心2 min(轉速10 800 r/min，離心半徑50 mm)，取上層清液于1.5 mL離心管中，40 ℃水浴氮氣吹干，100 μL流動相復溶，取2 μL進樣。

1.3方法學評價

1.3.1專屬性取空白血漿，MT和內標拉莫三嗪對照品溶液，給藥后大鼠血漿樣品經超高效液相色譜(ultra performance liquid chromatography,UPLC)法分析測定，MT和拉莫三嗪的保留時間為1.45 min、1.75 min。MT與峰形良好，分離完全，大鼠血漿中內源性物質不干擾MT的測定。

1.3.2標準曲線與最低檢測限在空白血漿180 μL中加入MT對照品溶液，分別制備血藥濃度為2.00、1.00、0.500、0.250、0.125、0.062 5、0.031 3 mg/L的血漿樣品。按“血漿樣品處理”操作，以MT峰面積和內標峰面積比(Y)為縱坐標，以所對應各點的血藥濃度(X)為橫坐標，經最小二乘法線性回歸，得標準曲線回歸方程為：Y=1.358X+0.006(r=0.999 5)。線性范圍：0.031 3～2.00 mg/L。最低檢測限為0.01 mg/L。

1.3.3精密度與回收率制備3種濃度(0.062 5 mg/L，0.500 mg/L，2.00 mg/L)的血漿質控樣品各5份，分別于1 d及連續5 d(每天1次)按“血漿樣品處理”操作后進樣測定考察日內精密度及日間精密度。同法，依據標準曲線計算檢測量，以檢測量與加入量的比計算相對回收率， 見表1。

表1回收率和精密度實驗結果

Table 1Results of recovery and precision tests

MT理論濃度(mg/L)日內精密度MT測得濃度(mg/L)RSD(%)日間精密度MT測得濃度(mg/L)RSD(%)相對回收率(%)0.06250.0604±0.019.430.0625±0.018.7596.69±9.120.500 0.470±0.025.20 0.480±0.011.0593.51±4.862.00 1.910±0.115.68 1.990±0.167.8795.33±5.42

1.3.4穩定性制備3種濃度(0.0625 mg/L，0.500 mg/L，2.00 mg/L )的血漿質控樣品各5份，分別考察質控樣品在室溫放置4 h、反復凍融3次及-40 ℃凍存5 d的穩定性，其相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)值分別為1.62%、5.43%、1.11%，均<10%，表明在上述條件下MT的穩定性良好。

1.4藥動學實驗取Wistar大鼠40只，隨機分為2組，每組20只，實驗組灌胃酒石酸MT(27 mg/kg)每天1次，連續6 d；對照組灌胃等量蒸餾水每天1次，連續6 d。2組于第7天同時灌胃酒石酸MT(27 mg/kg)后分別于0、0.17、0.33、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5、3、4、5 h眼內眥取血0.5 mL于裝有肝素鈉抗凝的離心管中，離心5 min(轉速10 800 r/min，離心半徑50 mm)取上層血漿，-40 ℃冰箱保存待測。

1.5統計學方法應用DAS 2.1.1軟件對每只大鼠的血藥濃度-時間數據進行擬合，并計算主要藥代動力學參數。應用SPSS 13.1軟件對2 組的藥動學參數進行統計學分析，其中滿足正態分布的進行t檢驗，不滿足正態性的進行非參數檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

血漿樣品自然解凍后按“血漿樣品處理”操作，UPLC法測定，根據標準曲線方程計算血藥濃度并繪制各組平均血藥濃度-時間曲線(圖1)。結果顯示，實驗組達峰時間(Tmax)和血藥峰濃度(Cmax)明顯短于或小于對照組，實驗組和對照組的其他藥動學參數如血藥濃度時間曲線下面積(area under curve，AUC)0-5 h、AUC0-∞、t1/2、CL、表觀分布容積(V)差異并無統計學意義(P>0.05)，見表2。

圖1對照組與實驗組平均藥-時曲線

Figure 1Average plasma concentration-time curve in control group and test group

表2大鼠體內酒石酸MT的藥代動力學參數

Table 2The pharmacokinetic parameters of metoprolol tartrate in rats

組別AUC0-5h(mg·h-1·L-1)AUC0-∞(mg·h-1·L-1)T1/2(h)Tmax(h)CL(L·h-1·kg-1)V(L/kg)Cmax(mg/L)實驗組0.84±0.400.91±0.411.23±0.360.51±0.1033.94±13.5958.19±22.610.71±0.40對照組0.96±0.461.05±0.501.42±0.410.85±0.2830.07±11.2061.54±30.5530.07±11.20t0.8800.9681.55713.6881.2730.39411.716P0.3390.3390.1280.0000.2110.6960.000

3討論

文獻中常用高效液相色譜[15]法和液相色譜半聯色譜[16]法測定酒石酸MT的血藥濃度。本研究采用UPLC法測定大鼠血漿中酒石酸MT的血藥濃度，與文獻中常用方法比較具有費用低、儀器易得、操作簡便、分析速度快、靈敏度高、節省試劑等優點。全面的方法學驗證后，證明所建立的方法專屬性、精密度、準確度、靈敏度均較好，適用于連續給藥 6 d前后大鼠體內酒石酸MT藥動學變化的研究。

本研究結果顯示穩態前后AUC0～5h、AUC0～∞、t1/2、CL、V差異并無統計學意義，表明連續灌胃大鼠酒石酸MT 6 d后達峰時間縮短，但體內并未存在蓄積現象，對大鼠體內藥動學無顯著影響；實驗組Tmax明顯短于對照組，表明穩態前的達峰時間明顯長于穩態后，造成這一結果的原因可能是因為第3次給藥前體內藥物尚未消除完全，隨著不斷給藥，體內藥物量不斷增加，達峰所用時間變短。

酒石酸MT在臨床上治療高血壓類心血管疾病時通常需要長期或者終身服用，本研究通過觀察穩態前后酒石酸MT在大鼠體內藥動學變化，為其在人體內的藥動學變化以及合理用藥提供了有力的依據。

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(本文編輯：許卓文)

Effects of continuously taking metoprolol tartrate on the pharmacokinetics in rats

ZHANG Ya-kun, WANG Wei-mei, GONG Ying, ZHANG Huan, ZHANG Zhi-qing*

(Department of Medicine, the Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000, China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the changes of continuous administration of metoprolol tartrate tablets in six days on the pharmacokinetic of in rats. MethodsForty rats were randomly divided into two groups with 20 rats in each group. Each rat in the test group was given metoprolol tartrate(27 mg/kg ), and each rat in the control group was given equal volume of distilled water orally，twice daily for 6 days. On day 7， each rat in two groups recieved a single dose of metoprolol tartrate(27 mg/kg). Blood samples were taken at different times after administration from the inner canthus. The concentrations of metoprolol tartrate were determined by ultra performance liquid chromatography(UPLC). The pharmacokinetic parameters of the two groups were calculated with DAS 2.1.1 pharmacokinetic software and were compared with SPSS 13.1 software. ResultsThe main pharmacokinetic parameters in the test group and control group:area under curve(AUC)(0-5 h) were(0.84±0.40) mg·h(-1)·L(-1) and(0.96±0.46) mg·h(-1)·L(-1), respectively; AUC(0-∞) were(0.91±0.41) mg·h(-1)·L(-1) and(1.05±0.50) mg·h(-1)·L(-1), respectively; half life(t(1/2)) were(1.23±0.36) h and(1.42±0.41) h, respectively; T(max) were(0.51±0.10) h and(0.85±0.28) h, respectively; V were(58.19±22.61) L/kg and(61.54±30.55) L/kg, respectively; plasma clearance(CL) were(33.94±13.59) L·h(-1)·kg(-1) and(30.07±11.20) L·h(-1)·kg(-1), respectively; peak concentration(C(max)) were(0.71±0.40) mg/L and(0.64±0.35) mg/L, respectively. There were no significant differences in parameters of AUC(0-5 h), AUC(0-∞), t(1/2), CL,V between control group and test group(P>0.05). There were significant difference in T(max) and C(max) between two groups.ConclusionThere has no accumulation and T(max) was shortened in rats given metoprolol tartrate for six days.

[Key words]metoprolol tartrate; pharmacokinetics； ultra performance liquid chromatography; rats

[中圖分類號]R971.94

[文獻標志碼]A

[文章編號]1007-3205(2016)03-0309-04

[作者簡介]張亞坤(1981-)，女，河北石家莊人，河北醫科大學第二醫院主管藥師，醫學碩士，從事臨床藥學研究。*通訊作者。E-mail:zhangzhq@medmail.com.cn

[收稿日期]2015-06-30；[修回日期]2015-07-21