補腎活血固齒方對MC3T3-E1細胞BMP2表達及TRPV5/TRPV6通道影響的實驗研究

高　毅，穆春暉，刁志虹，李　敏，王雙雙，楊　琳(⒈河北省中醫院口腔科,河北 石家莊 05007；.北京市東城區第一人民醫院口腔科，北京 0000；3.河北省石家莊市第一醫院口腔科，河北 石家莊 0500)

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·論著·

補腎活血固齒方對MC3T3-E1細胞BMP2表達及TRPV5/TRPV6通道影響的實驗研究

高毅1，穆春暉2，刁志虹3*，李敏1，王雙雙1，楊琳1(⒈河北省中醫院口腔科,河北 石家莊 050017；2.北京市東城區第一人民醫院口腔科，北京 100010；3.河北省石家莊市第一醫院口腔科，河北 石家莊 050011)

[摘要]目的觀察補腎活血固齒方對小鼠顱頂前成骨細胞(MC3T3-E1細胞)骨形態發生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP2)表達及TRPV5/TRPV6通道的影響，探討補腎活血固齒方成骨的作用機制。方法按體表面積折算等效劑量的補腎活血固齒方灌胃大鼠，制備含藥血清；等劑量生理鹽水灌胃大鼠，制備無藥血清作為對照。用10%含藥血清、無藥血清分別培養MC3T3-E1細胞24、48、72 h，RT-PCR法檢測MC3T3-E1細胞BMP2、TRPV5/TRPV6 mRNA的表達。結果含藥血清組MC3T3-E1細胞的BMP2、TRPV6 mRNA表達量較無藥血清組增加(P<0.05)，且隨時間延長有逐漸增加趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)。含藥血清組和無藥血清組MC3T3-E1細胞中均未檢測到TRPV5 mRNA的表達。結論補腎活血固齒方可能是通過鈣離子通道TRPV6上調BMP2的表達、誘導成骨細胞分化的。

[關鍵詞]牙周疾病；補腎活血固齒方；實時聚合酶鏈反應

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2016.03.009

牙周炎是以牙周袋形成、袋壁炎癥、牙槽骨進行性吸收和破壞、牙齒松動為主要癥狀的口腔常見病、多發病，牙周炎不僅導致成人牙齒過早喪失，并可誘發各種全身性疾病，嚴重影響其健康。中醫運用中藥，尤其是補腎中藥治療牙周炎引起的牙齒松動有著悠久歷史。根治牙周炎的關鍵是通過成骨細胞和破骨細胞的調節作用阻止牙槽骨吸收或促進牙槽骨的再生，成骨細胞在這一過程中發揮重要作用。成骨細胞表達的骨形態發生蛋白(bone morphogenetic proteins, BMPs)是骨修復中最主要的誘導因子，其亞型BMP2的誘導成骨能力較為明顯，BMP2通過Smads和p38MAPK信號通路促進成骨細胞表達多種特異性成骨因子如堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、骨鈣素(osteocalcin,OCN)，產生相應蛋白分泌到細胞外基質中，使細胞外基質礦化，進而完成成骨。鈣離子通道TRPV5/TRPV6通過調節成骨細胞內鈣離子含量的變化，激活p38MAPK通路，促進成骨細胞分化。本研究采用中藥血清體外培養小鼠顱頂前成骨細胞(MC3T3-E1細胞)，觀察補腎活血固齒方對細胞BMP2及TRPV5/TRPV6通道表達的影響，探討補腎活血固齒方對成骨細胞分化的作用機制，旨在為臨床用藥提供理論依據。

1材料與方法

1.1實驗動物清潔級健康雄性SD系大鼠20只，體質量280～300 g，由河北省實驗動物中心提供(實驗動物許可證號：冀醫動管字號1312020)。飼養條件：室溫保持在18～25 ℃，空氣流通，12 h維持光照，動物在籠中自由攝食飲水。

1.2中藥制備淫羊藿15 g、補骨脂15 g、熟地黃10 g、當歸10 g、丹參10 g、知母10 g、甘草3 g。藥物加10倍量蒸餾水煎煮1.5 h過濾，加同量蒸餾水重煎1.5 h過濾，合并濾液濃縮至150 mL裝袋備用(含生藥量 0.487 g/mL)。

1.3細胞株小鼠顱頂前成骨細胞亞克隆14 (MC3T3-E1 Subclone14)，購自中國科學院上海細胞庫 (ATCC CRL-2594)。

1.4主要試劑和儀器α-MEM培養基(GIBCO公司)，胎牛血清(PAA Laboraties GmbH)，葉酸(Amresco)， β-疏基乙醇(北京鼎國生物技術有限責任公司)，肌醇(北京索萊寶科技股份有限公司)，胰酶(Amresco)，乙二胺四乙酸(ethylene diamine totraacetic acid,EDTA)(天津市永大化學試劑開發公司)，戊巴比妥(華北制藥股份有限公司)，TAE緩沖液(Solarbio公司)，溴化乙錠(ethidium bromide,EB)(Solarbio公司)，瓊脂糖(Solarbio公司)，Trizol(Solarbio公司)，反轉錄試劑盒(Invitrogen公司)，PCR SuperMix擴增試劑盒(Invitrogen公司)，100 bp DNA Ladder(TANGEN)。HF240二氧化碳培養箱(上海力申科學儀器有限公司)，BSC-1100ⅡA2生物安全柜(北京東聯哈爾儀器制造有限公司)，TE2000-U熒光倒置顯微鏡(NiKon)，B40型醫用低速離心機(安新縣白洋離心機廠)，D-37520高速離心機(Thermo ELECTRON CORPORATION)，HKA-A2450-230精密電子天平(BEL Engineering)，DDY-7C型電泳儀(北京市六一儀器廠)，一體化凝膠成像分析儀(北京賽智創業科技有限公司)，96孔PCR儀(Applied Biosystems)。

1.5血清制備20只SD大鼠按隨機數字表法分為含藥血清組和無藥血清組，每組10只。含藥血清組的血清制備：補腎活血固齒方經煎制后，按體表面積折算等效劑量，0.487 g(生藥)/kg(體質量)計算用藥量。SD大鼠10只每日灌胃2次，連續灌胃7 d，第7天第2次灌胃后間隔2 h再次灌胃，末次灌胃1 h后，腹主動脈取血，3 000 r/min離心20 min，取上清，56 ℃水浴滅活30 min，抽濾除菌后，-20 ℃保存備用。無藥血清組的血清來自等劑量生理鹽水灌胃的大鼠，灌胃操作及血清制備方法同前。

1.6細胞培養MC3T3-E1細胞培養于α-MEM培養基(含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 g/L鏈霉素)，5% CO2，95%濕度，恒溫37 ℃的細胞培養箱中培養，每3 d換液1次，1周左右細胞基本鋪滿瓶底后傳代。吸去原培養液，PBS溶液清洗2遍，0.25%胰酶1 mL，37 ℃消化1 min，鏡下觀察細胞收縮，變圓，α-MEM培養基1.5 mL終止消化，反復吹打細胞，使其懸浮，移至離心管，1 000 r/min離心5 min，吸去上清液，加入適量α-MEM培養基，混懸細胞，每個培養瓶接種細胞30 000個。

1.7RT-PCR法檢測MC3T3-E1細胞中BMP2、TRPV5/TRPV6 mRNA的表達

1.7.1分組按“1.6”方法培養細胞2 d后分別換用含藥血清(培基含10%含藥血清)和無藥血清(培基含10%無藥血清)，繼續培養24、48、72 h，分別檢測不同時間點MC3T3-E1細胞BMP2、TRPV5/TRPV6 mRNA的表達。

1.7.2細胞總RNA的提取每瓶細胞，倒掉培基，PBS洗2遍，加入Trizol試劑1 mL，吹打混勻細胞，加入大EP管，冰上靜置10 min。加入氯仿200 μL，劇烈振蕩12 s，冰上靜置3 min,4 ℃，12 000 r/min離心15 min。吸取上層無色液相加入新的EP管中。新EP管加入500 μL異丙醇，混勻，冰上靜置10 min。12 000 r/min離心10 min，棄上清。EP管中加入1 mL 75%乙醇，振蕩使沉淀懸浮，靜置1 min。9 000 r/min離心10 min。吸干剩余乙醇。白色透明狀沉淀加入去核酶水20 μL，吹打混勻即為提取的總RNA，-20 ℃保存。

1.7.3逆轉錄反應分別取各樣品總RNA 5 μg，使用逆轉錄試劑盒進行逆轉錄，所得溶液即為cDNA，置冰浴待用。

1.7.4擴增反應TRPV5、TRPV6、BMP2、GAPDH引物序列及反應條件，見表1。

表1　TRPV5、TRPV6、BMP2、GAPDH引物序列及反應條件

1.7.5產物檢測PCR產物1 μL與5×100 bp DNA Ladder 5μL混勻加入瓊脂糖膠孔， 110 mV電壓電泳40 min，自動凝膠成像分析儀進行輝度掃描并觀察拍照，QuatityOne軟件進行輝度值比較。以GAPDH作為內對照，計算TRPV5、TRPV6、BMP2的相對含量，結果以TRPV5、TRPV6、BMP2條帶灰度值占GAPDH條帶灰度值的百分率表示mRNA的表達量。

1.8統計學方法應用SPSS 13.0統計學軟件進行數據分析，計量資料比較分別采用t檢驗和F檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1RT-PCR法檢測BMP2 mRNA表達2組MC3T3-E1細胞中均有BMP2 mRNA表達，且表達量隨時間的延長有增加趨勢，但組內24、48、72 h之間差異無統計學意義(P>0.05)；而含藥血清組24、48、 72 h BMP2 mRNA表達量均較無藥血清組高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表22組不同時間BMP2 mRNA表達比較

Table 2BMP2 mRNA expression level at different time

points in two groups

組別培養時間24h48h72hFP無藥血清組0.040±0.0270.044±0.0210.048±0.0270.1520.861含藥血清組0.081±0.0360.088±0.0180.098±0.0150.7120.506t 2.2323.8973.965P 0.0490.0030.003

2.2RT-PCR法檢測TRPV5/TRPV6 mRNA表達2組MC3T3-E1細胞中均無TRPV5 mRNA表達。2組MC3T3-E1細胞中均有TRPV6 mRNA表達，且表達量均隨時間的延長有逐漸增加趨勢，但組內24、48、72 h之間差異無統計學意義(P>0.05)；而含藥血清組24、48和72 h TRPV6 mRNA表達量均較無藥血清組高，差異有統計學意義(P<0.01)。見表3。

表32組不同時間TRPV6 mRNA表達比較

Table 3TRPV6 mRNA expression level at different time

points in two groups

組別培養時間24h48h72hFP無藥血清組0.094±0.0310.106±0.0230.115±0.0290.8570.444含藥血清組0.292±0.0690.301±0.0420.311±0.0360.2080.815t 6.4129.97510.380P 0.0000.0000.003

3討論

“血清藥理學”由田代真一于1988年提出，原理是使用中藥或中藥復方給動物灌服一定時間后采集、分離動物血清，用含有藥物成分的血清進行體外實驗的一種半體內實驗方法[1]。該方法可有效防止中藥制劑自身理化性質對實驗的干擾，反映中藥在胃腸道內的消化吸收、生物轉化、產生藥效的真實過程，克服了中藥制劑的體內代謝物或機體反應物等有效成分引起的假陰性和機體非吸收物的體外作用造成的假陽性[2]，客觀模擬了藥物與機體的相互作用，代表了藥物在體內產生作用的真正有效成分。

BMPs是促進骨形成和誘導成骨細胞分化的重要細胞因子[3]。BMPs可以誘導前成骨細胞向成骨細胞分化，誘導未定型和定型的成骨細胞經過趨化、分裂、分化等過程，不可逆的分化成骨[4]。BMPs的亞型BMP2的誘導成骨能力較為明顯，研究表明BMP2通過Smads和p38MAPK信號通路調控成骨細胞分化，BMP2與Ⅱ型受體(type Ⅱ bone morphogenetic protein receptor,BMPR-Ⅱ)結合后磷酸化Ⅰ型受體(BMPR-Ⅰ)，磷酸化的BMPR-Ⅰ進一步磷酸化與BMPs特異作用的Smads蛋白，Smads蛋白進入細胞核后通過增加特異性轉錄因子Runx2的表達促進ALP合成，進而促進成骨細胞分化[5-6]。BMP2也可以與BMPR-Ⅰ形成復合體，復合體與橋蛋白作用，介導下游信號分子TAB1的活化，活化的TAB1激活TAK1信號途徑，TAK1信號途徑進而激活p38MAPK通路，從而促進成骨細胞表達ALP[7-8]。ALP是骨形成所必需的酶，ALP 的表達標志成骨細胞分化的開始，ALP活性是成骨細胞功能及分化程度的指標[9-10]。ALP表達升高是啟動礦化的必備條件，作用是水解磷酸酯為沉積羥基磷灰石提供必要的磷酸，水解焦磷酸鹽，解除其對礦物質形成的抑制作用，從而促進羥磷灰石的形成，促進細胞成熟、鈣化[11-12]。本研究結果顯示，含藥血清和無藥血清培養的MC3T3-E1細胞均有BMP2 mRNA表達，含藥血清BMP2 mRNA表達量較無藥血清高。表明含藥血清可顯著地增加BMP2 mRNA的表達水平。因此，認為補腎活血固齒方可通過提高BMP2 mRNA表達水平誘導MC3T3-E1細胞的成骨分化。

TRPV5/TRPV6通道是高選擇性鈣離子通道，細胞內鈣離子濃度較低時，鈣離子通過該通道進入細胞，參與多種信號通路調控成骨細胞的分化、成熟以及骨的形成[13]。Hoenderop等[14]研究表明，TRPV5/TRPV6通道通過調節成骨細胞內鈣離子含量的變化，調節p38MAPK信號通路，最終調節成骨細胞增殖及骨代謝；p38MAPK通路可以調節成骨細胞分化過程中ALP的表達，促進成骨細胞分化成熟。本研究發現含藥血清和無藥血清培養的MC3T3-E1細胞中均有TRPV6 mRNA表達，且表達量均隨時間的延長而增加，含藥血清組的表達量較無藥血清高(P<0.05)；而含藥血清及無藥血清培養的MC3T3-E1細胞中均未檢測到TRPV5 mRNA的表達。李富春等[15]實驗發現，大鼠成骨細胞分化過程中 TRPV5/TRPV6 通道均有不同程度陽性表達，且TRPV5/TRPV6 的表達隨誘導分化時間的延長逐漸增強。van der Eerden等[16]在人股骨分離的成骨細胞中沒有檢測到TRPV5 mRNA。這些研究結果與本研究結果相符，但這些結果無法確定TRPV5通道在MC3T3-E1細胞中不存在，TRPV5 mRNA的表達是否存在窗口期或者需要特定的激活條件，需要進一步研究。

本研究結果表明，補腎活血固齒方可提高MC3T3-E1細胞中BMP2、TRPV6 mRNA的表達水平，進而通過p38MAPK信號通路調節成骨細胞分化和骨代謝。

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(本文編輯：許卓文)

The experimental study of effects of Bushen Huoxue Guchi formula on BMP2 and TRPV5/TRPV6 channels expressions in MC3T3-E1 cells

GAO Yi1, MU Chun-hui2, DIAO Zhi-hong3*, LI Min1,WANG Shuang-shuang1, YANG Lin1

(1.Department of Stomatology, the Hospital of Traditional Chinese Medicine, Hebei Province, Shijiazhuang 050017, China; 2.Department of Stomatology,the First People′s Hospital of Beijing Dongcheng District, Beijing100010, China; 3.Department of Stomatology,the First Hospital of Shijiazhuang City,Hebei Province, Shijiazhuang 050011, China)

[Abstract]ObjectiveTo observe the effect of Bushen Huoxue Guchi Formula on bone morphogenetic protein 2(BMP2) and TRPV5/TRPV6 channel expressions, and to explore the mechanism of Bushen Huoxue Guchi Formula in bone formation. MethodsHerb-contained serum was prepared from rats by gavage with Bushen Huoxue Guchi Formula by using body surface area converted equivalent dose. Blank-contained serum as control group was prepared by gavage with normal saline. The BMP2 and TRPV5/TRPV6 mRNA expressions were detected in MC3T3-E1 cells by RT-PCR after the cells were treated with 10% herb-contained serum or blank-contained serum for 24 h, 48 h and 72 h, respectively. ResultsBMP2, TRPV6 mRNA were significantly increased in herb-contained serum treatment group compared with blank-contained serum treatment group(P<0.05). With the prolongation of time, the mRNA expression of BMP2 and TRPV6 had a gragually increased tendency, but there was no statistically significant difference(P>0.05). TRPV5 mRNA was not detected either in herb-contained serum treatment group or blank-contained serum treatment group. ConclusionBushen Huoxue Guchi Formula may upregulate BMP2 expression through TRPV6 channels to induce differentiation of osteoblast.

[Key words]periodontal diseases; Bushen Huoxue Guchi Formula; real-time polymerase chain reaction

[中圖分類號]R781.4

[文獻標志碼]A

[文章編號]1007-3205(2016)03-0280-05

[作者簡介]高毅(1965-)，女，河北行唐人，河北省中醫院主任醫師，醫學博士，從事口腔疾病診治研究。*通訊作者。E-mail:yanjingshe651130@163.com

[基金項目]河北省科學技術研究與發展計劃項目(13277730D)；河北省中醫藥管理局科研計劃項目(2014028)

[收稿日期]2016-01-29；[修回日期]2016-03-01