microRNA-151檢測(cè)用于評(píng)價(jià)卵巢癌鉑類藥物療效的臨床價(jià)值

蘇　純，李巧云，范　梅，陸　林

1)鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科 鄭州 450052　2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院超聲科 鄭州 450052　3)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院放射科 鄭州 450052

△女，1971年6月生，本科，副主任醫(yī)師，研究方向：婦科腫瘤,E-mail：suchun5h@163.com

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microRNA-151檢測(cè)用于評(píng)價(jià)卵巢癌鉑類藥物療效的臨床價(jià)值

蘇純1)△，李巧云1)，范梅2)，陸林3)

1)鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科 鄭州 4500522)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院超聲科 鄭州 4500523)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院放射科 鄭州 450052

△女，1971年6月生，本科，副主任醫(yī)師，研究方向：婦科腫瘤,E-mail：suchun5h@163.com

關(guān)鍵詞卵巢癌；化療；microRNA；Bcl-2

摘要目的：探討microRNA檢測(cè)用于評(píng)價(jià)卵巢癌患者鉑類藥物療效的臨床價(jià)值。方法：研究納入接受順鉑化療的初治卵巢癌患者88例，根據(jù)ATP-TCA結(jié)果分為敏感組(45例)和耐藥組(43例)。microRNA微陣列分析2組患者血清microRNA表達(dá)的差異，并使用qRT-PCR加以驗(yàn)證。繪制ROC曲線，分析microRNA-151高表達(dá)與卵巢癌化療不敏感現(xiàn)象的關(guān)系。體外培養(yǎng)SKOV3細(xì)胞并轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-microRNA-151或pcDNA3.1空質(zhì)粒，使用3 μmol/L順鉑處理細(xì)胞48 h，計(jì)算細(xì)胞存活率，同時(shí)采用qRT-PCR及Western blot檢測(cè)microRNA-151對(duì)細(xì)胞Bcl-2表達(dá)的影響。結(jié)果：與敏感組患者相比，耐藥組患者中有5種microRNA表達(dá)上調(diào)，5種microRNA表達(dá)下調(diào)。microRNA-151水平的檢測(cè)對(duì)于評(píng)價(jià)卵巢癌患者鉑類藥物療效有臨床價(jià)值(AUC=0.719, 95%CI=0.607～0.831)，高microRNA-151水平的患者發(fā)生對(duì)鉑類藥物不敏感的風(fēng)險(xiǎn)較高。高表達(dá)microRNA-151可減弱SKOV3細(xì)胞對(duì)鉑類藥物的敏感性，提高Bcl-2的表達(dá)(P均<0.05)。結(jié)論：檢測(cè)microRNA-151水平可以評(píng)估卵巢癌患者對(duì)鉑類藥物的敏感性。

Clinical value of microRNA-151 in evaluating effect of platinum drugs on patients with ovarian cancer

SUChun1),LIQiaoyun1),FANMei2),LULin3)

1)DepartmentofGynecologyandObstetrics,theFifthAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500522)DepartmentofUltrasound,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500523)DepartmentofRadiology,theThirdAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

Key wordsovarian cancer;chemotherapy;microRNA;Bcl-2

AbstractAim: To investigate the clinical value of microRNA-151 in evaluating effect of platinum drugs on patients with ovarian cancer.Methods: Eighty-eight ovarian cancer patients treated with platinum drugs were allocated into sensitive group and insensitive group according to the result of ATP-TCA test. MicroRNA microarray was used to detect the change of microRNA expression between two groups and the results was proven by qRT-PCR. The clinical value of detecting microRNA-151 was estimated by ROC curves. Furthermore, SKOV3 cells were cultured in vitro and transfected with pcDNA3.1-microRNA-151 or empty pcDNA3.1. Non-transfected SKOV3 cells and transfected SKOV3 cells were treated with 3 μmol/L cisplatin for 48 h and CCK-8 assay was used to calculate the viability of different cells. Finally, the Bcl-2 expression change induced by microRNA-151 was confirmed by qRT-PCR and Western blot.Results: Compared with sensitive group, in insensitive group,5 kinds of microRNA expression were decreased and 5 were increased.ROC curves supported that microRNA-151 had effectively clinical value to assess the sensitivity of ovarian cancer patients to platinum drugs(AUC=0.719, 95%CI=0.607-0.831). High-expressed microRNA-151 was a risk factor for ovarian cancer patients to induce resistance to platinum drugs; moreover, high-expressed microRNA-151 could induce the resistance of SKOV3 cells to platinum drugs and increase Bcl-2 expression(P<0.05).Conclusion: MicroRNA-151 could be used to evaluate the sensitivity of ovarian cancer patients to platinum drugs.

基于鉑類藥物的聯(lián)合化療方案已經(jīng)成為臨床上治療實(shí)體腫瘤的成熟方案，其在卵巢癌的治療中效果較為明確[1-2]。然而，不同個(gè)體對(duì)鉑類藥物的敏感性有較大差異，一些患者對(duì)鉑類藥物的敏感性達(dá)不到預(yù)期[3]。因此對(duì)患者鉑類藥物敏感性的評(píng)估較為重要。microRNA檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)較為成熟，且對(duì)于microRNA與腫瘤化療敏感性的研究[4]已經(jīng)有所報(bào)道。如有研究[5]發(fā)現(xiàn)，microRNA-221和microRNA-222的高表達(dá)介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)阿霉素的耐藥性。microRNA-429和microRNA-196則與結(jié)腸癌一線化療藥物的治療效果密切相關(guān)[6]。還有研究[7]指出，在卵巢癌中存在microRNA表達(dá)譜的差異，且這些microRNA的表達(dá)變化可能預(yù)示卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展。該研究旨在探討microRNA表達(dá)差異與鉑類藥物治療敏感性的關(guān)系及機(jī)制。

1對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象研究納入2013年1月至2014年4月于鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院就診及治療的經(jīng)病理學(xué)確診的卵巢癌患者88例，年齡35～75歲，中位年齡51歲。分期參照國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟制定的標(biāo)準(zhǔn)，其中Ⅰ～Ⅱ期10例，Ⅲ～Ⅳ期78例。所有患者術(shù)前未經(jīng)過化療、放療以及相關(guān)的內(nèi)分泌或生物治療?；颊甙肽陜?nèi)不曾服用免疫調(diào)節(jié)制劑和激素類藥物。Ⅰ期患者接受合理分期手術(shù)，Ⅱ～Ⅳ期患者接受細(xì)胞減滅術(shù)。所有患者術(shù)后均接受紫杉醇聯(lián)合順鉑為主的化療方案3～6個(gè)周期。術(shù)中留取新鮮癌組織標(biāo)本用于藥物敏感性的檢測(cè)。血清標(biāo)本于術(shù)前采集并常規(guī)低溫保存。

1.2研究對(duì)象對(duì)順鉑敏感性的檢測(cè)采用ATP-TCA體外藥敏檢測(cè)法對(duì)患者組織標(biāo)本進(jìn)行順鉑藥敏檢測(cè)，嚴(yán)格按照試劑盒中提供的說明書進(jìn)行操作。主要步驟為：剪碎術(shù)中留取的新鮮癌組織標(biāo)本，組織解離酶消化酶解后，離心并制備細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液加入含0.0%、12.5%、25.0%、50.0%、100.0%血漿峰值濃度的順鉑無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)1周，同時(shí)設(shè)置對(duì)照，即未加藥物的陰性細(xì)胞對(duì)照及未加細(xì)胞的空白對(duì)照。培養(yǎng)1周后，加入ATP提取液提取細(xì)胞中的ATP，加入熒光素-熒光酶素試劑，檢測(cè)熒光值，以反映腫瘤細(xì)胞的活性。

1.3microRNA微陣列分析采集患者術(shù)前靜脈血標(biāo)本并分離血清， 采用microRNA 芯片(丹麥Exiqon公司)進(jìn)行microRNA 微陣列分析。采用Trizol試劑提取總RNA，采用microRNA分離試劑盒(美國Invitrogen公司)分離并純化microRNA。用T4 RNA連接酶(美國Invitrogen公司)對(duì)microRNA進(jìn)行熒光標(biāo)記，將帶有標(biāo)記的microRNA與微陣列芯片雜交，雜交時(shí)間為12 h。雜交結(jié)束后，采用Luxscan10K/A掃描系統(tǒng)(博奧生物有限公司)進(jìn)行芯片掃描，并用Significance Analysis of Microarrays 2.0軟件進(jìn)行結(jié)果分析。

1.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)驗(yàn)證microRNA表達(dá)變化采用Pure Mini microRNA提取試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)分離提取樣本中的microRNA，采用TaqMan microRNA Reverse Transcription試劑盒(美國Life Technologies公司)反轉(zhuǎn)錄micorRNA生成cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系和條件參考說明書。qRT-PCR采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ Kit[寶生物工程(大連)有限公司]在7900HT Fast RT-PCR System(美國Life Technologies公司)中進(jìn)行。反應(yīng)體系參照試劑盒說明書。hsa-microRNA-151引物序列為：5’-CGCCTAGACTGAAGCTCCT-3’(上游)，5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’(下游)。hsa-microRNA-451引物序列為：5’-ACCGUUAC CAUUACUGAGUU-3’(上游)，5’-CUCAGUAAUG GUAACGGUUUUU-3’(下游)。采用microRNA-16作為內(nèi)參，其引物序列為：5’-CGCGCTAGCAGCACGTA AAT-3’(上游)，5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’(下游)。采用2-ΔCt計(jì)算hsa-microRNA-151 和hsa-microRNA-451的表達(dá)水平，其中ΔCt=Ct目標(biāo)-Ct內(nèi)參。

1.5microRNA與卵巢癌患者化療敏感性的關(guān)系

根據(jù)ATP-TCA藥敏結(jié)果將患者分為順鉑敏感組和耐藥組。繪制ROC曲線驗(yàn)證microRNA檢測(cè)評(píng)估敏感程度的效能，通過單因素以及l(fā)ogistic回歸分析確定變化的microRNA水平與療效的關(guān)系。

1.6SKOV3細(xì)胞的培養(yǎng)與microRNA的轉(zhuǎn)染卵巢癌SKOV3細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心細(xì)胞庫，培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，培養(yǎng)環(huán)境為體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37 ℃。采用由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)并構(gòu)建的pcDNA3.1-microRNA-151表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞，同時(shí)以轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空質(zhì)粒的細(xì)胞作為陰性對(duì)照。采用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒(美國Invitrogen公司)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，方法參考試劑盒說明書。

1.7microRNA-151轉(zhuǎn)染對(duì)SKOV3細(xì)胞順鉑敏感性的影響細(xì)胞分組：未經(jīng)任何處理的SKOV3細(xì)胞作為對(duì)照組、3 μmol/L順鉑處理的未經(jīng)轉(zhuǎn)染的SKOV3細(xì)胞、3 μmol/L順鉑處理的轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-microRNA-151的SKOV3細(xì)胞以及3 μmol/L順鉑處理的轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空質(zhì)粒的SKOV3細(xì)胞。在96孔板中接種各組細(xì)胞懸液(100 000個(gè)/孔)，常規(guī)培養(yǎng)48 h，向每孔加入10 μL CCK-8試劑(上海博谷生物科技有限公司)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處各組細(xì)胞的吸光度，按照公式細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組吸光度/對(duì)照組吸光度)×100%計(jì)算各組細(xì)胞的存活率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8microRNA轉(zhuǎn)染對(duì)SKOV3細(xì)胞Bcl-2表達(dá)的影響細(xì)胞分為轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-microRNA-151組、轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空質(zhì)粒組和未轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染方式同1.6。收集處理后的SKOV3細(xì)胞，Trizol提取各組細(xì)胞的總RNA。采用ImProm-Ⅱ反轉(zhuǎn)錄試劑盒[普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司]對(duì)提取出的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以合成cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系參照試劑盒提供的說明書。采用GO Taq qPCR Master Mix試劑盒[普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司]對(duì)合成的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。Bcl-2上游引物為5’-TTCTTTGAGTTCGGTGGGGTC-3’，下游引物為5’-TG CATATTTGTTTGGGGCAGG-3’；GAPDH上游引物為5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’，下游引物為5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。反應(yīng)體系和條件參照試劑盒說明書。采用2-ΔΔCt法分析各樣本Bcl-2 mRNA的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。敏感組和耐藥組microRNA的表達(dá)水平以中位數(shù)表示，比較采用Mann-Whitney秩和檢驗(yàn)；各組細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性以及Bcl-2表達(dá)水平的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

根據(jù)ATP-TCA結(jié)果，可將所有患者分為順鉑敏感組和耐藥組。其中敏感組45例，年齡35～70歲，中位年齡53歲；耐藥組43例，年齡40～75歲，中位年齡52歲。

2.1microRNA微陣列分析結(jié)果與敏感患者相比，耐藥患者血液標(biāo)本中共有10種microRNA出現(xiàn)了差異表達(dá)，其中5種出現(xiàn)降低，5種出現(xiàn)增高，且hsa-microRNA-415的降低程度最為顯著，hsa-microRNA-151的增高程度最為顯著，見表1。

表1　敏感組和耐藥組間10種microRNA信號(hào)強(qiáng)度比較

2.2qRT-PCR對(duì)hsa-microRNA-415和hsa-microRNA-151差異表達(dá)的驗(yàn)證敏感組和耐藥組hsa-microRNA-415表達(dá)的中位數(shù)分別為3.410(0.192～12.381)與3.000(0.262～9.000)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=0.667，P=0.611);hsa-microRNA-151表達(dá)的中位數(shù)分別為5.438(0.910～13.051)與 6.890(0.482～16.213)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=2.530，P=0.032)。

2.3microRNA-151與卵巢癌患者對(duì)鉑類藥物敏感性的關(guān)系ROC曲線下面積(AUC)為0.719(95%CI=0.607～0.831)，最佳截?cái)嘀禐?.05，對(duì)應(yīng)的敏感性為66.7%，特異度為89.1%，見圖1。以6.05為界限，將患者microRNA-151水平<6.05劃分為低microRNA-151組，其余患者劃分為高microRNA-151組，2組患者的治療效果見表2。Logistic回歸分析證實(shí)高microRNA-151水平是患者發(fā)生化療不敏感現(xiàn)象的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，見表3。

2.4microRNA-151高表達(dá)抑制SKOV3細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性結(jié)果見表4。

2.5microRNA-151高表達(dá)誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞Bcl-2的高表達(dá)結(jié)果見表4、圖2。

圖1　microRNA-151評(píng)估鉑類藥物耐藥的ROC曲線

例

OR=4.139,95%CI=1.713～10.454,χ2=10.234,P<0.001。

表3　microRNA-151預(yù)測(cè)卵巢癌患者

表4　microRNA-151轉(zhuǎn)染對(duì)SKOV3細(xì)胞存活率及Bcl-2 mRNA表達(dá)水平的影響

*：與其他2組比較，P<0.05。

A：正常SKOV3細(xì)胞；B：轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-microRNA-151質(zhì)粒的SKOV3細(xì)胞；C：轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空質(zhì)粒的SKOV3細(xì)胞。圖2　microRNA-151高表達(dá)對(duì)SKOV3細(xì)胞Bcl-2表達(dá)的影響

3討論

卵巢癌是致死率較高的婦科惡性腫瘤，70%的患者在明確診斷時(shí)已為晚期。目前，臨床治療卵巢癌的方案是腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)聯(lián)合化療?；煹某Ｓ梅桨甘且糟K類為主的聯(lián)合化療，因?yàn)殂K類藥物具有費(fèi)用低、不良反應(yīng)少、效果明確且抗癌譜廣泛的優(yōu)點(diǎn)[8]。順鉑是常用的鉑類藥物，報(bào)道[9]稱以順鉑為主的聯(lián)合化療的完全緩解率應(yīng)為60%左右，但實(shí)際的臨床效果卻低于此。越來越多的證據(jù)[10]表明microRNA的差異表達(dá)與腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性有關(guān)。通過microRNA芯片檢測(cè)，作者發(fā)現(xiàn)了對(duì)鉑類藥物治療不敏感的患者存在microRNA-151的高表達(dá)，且microRNA-151轉(zhuǎn)染可降低SKOV3細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。

microRNA影響化療敏感性的機(jī)制較復(fù)雜[11]。該研究選取凋亡調(diào)控因子Bcl-2作為研究點(diǎn)。大量研究[12-14]表明Bcl-2的表達(dá)與腫瘤對(duì)化療藥物的敏感性有關(guān)，Bcl-2高表達(dá)時(shí)，氟尿嘧啶、長春新堿、表阿霉素、奧沙利鉑對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率明顯降低。該研究發(fā)現(xiàn)microRNA-151的轉(zhuǎn)染可導(dǎo)致SKOV3細(xì)胞Bcl-2的表達(dá)顯著增高，因此推測(cè)microRNA-151表達(dá)增高可能增加Bcl-2的表達(dá)水平，減少凋亡，從而降低卵巢癌患者對(duì)鉑類藥物的敏感性。當(dāng)然，該研究未能闡述microRNA-151如何增加Bcl-2的表達(dá)，也未能闡述除Bcl-2外還有哪些凋亡調(diào)控因子與microRNA-15有關(guān)，這有待于進(jìn)一步研究。

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doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.02.021