孕婦血漿中胎兒特異性C21orf105、PLAC4 mRNA的檢測*

許雅娟，張瑩瑩，羅曉華，翟閃閃，冉利敏，任利單，洪　騰

鄭州大學第三附屬醫院產科 鄭州 450052

△女，1963年4月生，本科，主任醫師，研究方向：圍產醫學，E-mail：cnzzzsl@163.com

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孕婦血漿中胎兒特異性C21orf105、PLAC4 mRNA的檢測*

許雅娟△，張瑩瑩，羅曉華，翟閃閃，冉利敏，任利單，洪騰

鄭州大學第三附屬醫院產科 鄭州 450052

△女，1963年4月生，本科，主任醫師，研究方向：圍產醫學，E-mail：cnzzzsl@163.com

關鍵詞21-三體綜合征；C21orf105；PLAC4;血漿

摘要目的：探討孕婦血漿中胎兒特異性C21orf105、PLAC4 mRNA的穩定性及其表達量檢測的臨床價值。方法：①收集30例健康單胎妊娠婦女的血樣，分為8組，其中4組分別在室溫中放置0、6、24、72 h，余4組分別于4 ℃條件下放置0、6、24、72 h，然后采用實時熒光定量RT-PCR法檢測C21orf105、PLAC4 mRNA。②收集健康單胎妊娠婦女的血樣，其中經染色體核型分析證實胎兒為21-三體綜合征的孕婦38例，胎兒染色體正常的孕婦40例，同法檢測血漿C21orf105、PLAC4 mRNA。結果：30例孕婦血漿中均能檢測到C21orf105、PLAC4 mRNA，孕婦血漿室溫放置72 h后，C21orf105、PLAC4 mRNA無明顯降解(P>0.05)。21-三體綜合征胎兒孕婦血漿中C21orf105、PLACA4 mRNA表達量高于正常胎兒孕婦(P<0.001)。結論：母體血漿中C21orf105、PLAC4 mRNA很穩定，其檢測有望成為21-三體綜合征產前篩查的有效指標。

Plasma levels of fetal-specific C21orf105 and PLAC4 mRNA of pregnant women with trisomy 21 syndrome fetus

XUYajuan，ZHANGYingying，LUOXiaohua，ZHAIShanshan，RANLimin，RENLidan，HONGTeng

DepartmentofObstetrics,theThirdAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

Key wordstrisomy 21 syndrome;C21orf105;PLAC4;plasma

AbstractAim: To explore the stability of the fetal-specific C21orf105 and PLAC4 mRNA and their expressions in the maternal plasma of pregnant women with trisomy 21 syndrome fetus.Methods: The plasma of 30 healthy and singleton pregnant women were collected and allocated in 8 groups, 4 groups were stored for 0,6,24 and 72 h at 4 ℃, and the other 4 groups were stored for 0,6,24 and 72 h at room temperature,respectively, then the expressions of C21orf105 and PLAC4 mRNA were detected using real-time RT-PCR.A total of 40 blood samples from normal pregnant women and 38 samples from trisomy 21 syndrome fetus pregnant women were collected to detect C21orf105 and PLAC4 mRNA in maternal plasma.Results: C21orf105 and PLAC4 mRNA could be detected in all the maternal plasma samples, even in maternal plasma samples stored at room temperature for 72 h, and there was no significant differences among the 8 groups(P>0.05).The mRNA expression levels of C21orf105 and PLAC4 in maternal plasma of the trisomy 21 syndrome pregnant women were higher than those of the normal controls(P<0.001).Conclusion: C21orf105 and PLAC4 mRNA in maternal plasma is stable enough to be amplified,and they are potential markers for prenatal screening of trisomy 21 syndrome.

21-三體綜合征是人類最常見的染色體疾病，發生率約1/800，絕大多數患者表現為嚴重智力障礙及多種臟器的異常[1]。染色體核型分析是檢測胎兒21-三體綜合征的金標準[2]，但其為侵入性操作，且操作復雜,花費時間較長，費用高，難以被孕婦接受,因此亟需一種能夠在孕早期實施且安全、簡便、敏感性和特異性均較高的非侵入性產前篩查與診斷方法。母血中胎兒游離mRNA的發現為胎兒染色體非整倍體疾病的非侵入性產前篩查開辟了新的方向[3]。C21orf105[4]和PLAC4[5]mRNA位于21號染色體唐氏綜合征關鍵區，具有胎兒特異性、妊娠特異性，孕早期即可在孕婦血漿中檢測到，產后迅速消失。目前孕婦血漿中C21orf105和PLAC4 mRNA表達與胎兒21-三體綜合征之間的關系尚存有爭議[6-8]，且對于離體血標本的存放溫度及處理時間也無統一標準。該研究旨在探討采用實時熒光定量RT-PCR法定量分析孕婦外周血中C21orf105、PLAC4 mRNA的方法穩定性及其在胎兒21-三體綜合征產前篩查方面的價值。

1材料與方法

1.1標本來源①選取2014年6月至9月在該院門診行圍產保健的健康單胎妊娠婦女30例,均為初產婦，年齡(27.6±5.2)歲；抽取其外周血15 mL，分為8組(A0、A1、A2、A3組和B0、B1、B2、B3組)，用于孕婦外周血中C21orf105、PLAC4 mRNA穩定性的研究。 ②2013年7月至2014年9月鄭州大學第三附屬醫院共行羊水穿刺及染色體核型分析2 100例。選擇門診行圍產保健的身體健康且均為單胎妊娠、經染色體核型分析證實胎兒為21-三體綜合征的孕婦38例作為病例組，胎兒染色體正常的孕婦40例作為對照組。該兩組孕婦血漿標本用于C21orf105、PLAC4 mRNA表達與胎兒21-三體綜合征關系的研究。

1.2母體血漿中C21orf105、PLAC4 mRNA的檢測

1.2.1標本處理對血標本進行“二步離心”處理[9]。4 ℃條件下1 600× g低速離心10 min，將上清液移入新的無RNase的EP管中；在4 ℃條件下16 000 g高速離心10 min，將上清液移入無RNase的EP管中；加入TRI 試劑(MRC公司)，于-80 ℃條件下保存。用于mRNA穩定性研究的標本經“二步離心”后， A0、A1、A2、A3組于室溫中分別放置0、6、24、72 h后加入TRI試劑，B0、B1、B2、B3組于4 ℃條件下分別放置0、6、24、72 h后加入TRI 試劑，劇烈振蕩后于-80 ℃保存。

1.2.2血漿總RNA的提取及反轉錄血漿總RNA的提取使用美國MRC公司的TRI試劑，具體步驟按說明書操作，分光光度儀檢測RNA濃度和純度后，立即進行反轉錄。使用日本TOYOBO公司的ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover試劑盒，總反應體系為20 μL：12 μL RNA于65 ℃條件下熱變性5 min后，立即置于冰上，加入4 μL 4×DN Master Mix(已添加gDNA Remover)，置于37 ℃條件下5 min，加入 4 μL 5×RT Master Mix Ⅱ，37 ℃ 15 min，50 ℃ 5 min，98 ℃ 5 min，反應結束后，產物于-20 ℃保存。上述反應液均在冰上配置。如無特殊說明，離心條件均為4 ℃ 16 000× g離心10 min。

1.2.3實時熒光定量PCR在NCBI數據庫檢索C21orf105和PLAC4序列, 使用軟件Primer Express 2.0 設計PCR引物，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列見表1。采用康為世紀公司的UltraSYBR Mixture(With ROX)試劑盒進行實時熒光定量PCR，以β-actin作為內參基因。總反應體系包括2×Ultra SYBR Mixture 10 μL，上、下游引物各0.8 μL，cDNA 2 μL。反應條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個循環;于60 ℃收集熒光信號。每個標本重復3次。儀器為美國ABI 7500 real-time PCR System。采用2-ΔΔCt法計算最終結果。

表1　PCR引物序列

1.3統計學處理采用SPSS 17.0進行統計分析，采用析因設計的方差分析來評判血樣存放時間和溫度對C21orf105、PLAC4 mRNA測定結果的影響；病例組和對照組孕婦血漿中兩種mRNA表達量的比較采用兩獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。

2結果

2.1實驗質量評估各組PCR產物的溶解曲線均為單峰，無非特異性擴增等情況。孕婦血漿中均能檢測到C21orf105、PLAC4 mRNA和β-actin mRNA，檢出率為100%。

2.2孕婦血漿中C21orf105、PLAC4 mRNA的穩定性以A3、B3組為例，擴增曲線見圖2。8組C21orf105、PLAC4 mRNA檢測結果見表2、表3。標本存放溫度和時間對血漿中C21orf105、PLAC4mRNA的測定無顯著影響，孕婦血漿中C21orf105、PLAC4 mRNA穩定性較好。

從上到下依次為C21orf105、A3組PLAC4、B3組C21orf105、B3組PLAC4。圖2　A3及B3組的擴增曲線

t(處理)/hT(存放)室溫4℃00.044±0.0490.044±0.04960.031±0.0280.041±0.018240.045±0.0280.034±0.006720.047±0.0510.048±0.022

Ft=2.608,P=0.052；FT=0.417,P=0.519；F交互=0.244,P=0.866。

表3　孕婦血漿中PLAC4 mRNA檢測結果(n=3)

Ft=1.555,P=0.201；FT=0.408,P=0.524；F交互=0.668,P=0.573。

2.3病例組和對照組孕婦血漿中C21orf105、PLAC4 mRNA表達量的比較兩組孕婦的年齡、孕齡、孕次差異無統計學意義(表4)，具有可比性。病例組孕婦血漿中C21orf105、PLAC4 mRNA表達量均高于對照組，見表5。

表4　兩組孕婦一般情況比較

表5　兩組孕婦血漿中

3討論

目前，胎兒染色體疾病的產前篩查方法有超聲學檢查及血清學篩查，但均存在敏感性和特異性低的問題，而無創產前DNA篩查技術費用較高，不適于普遍篩查。胎兒C21orf105[4]和PLAC4[5]基因均位于21號染色體上，孕早期孕婦血漿中即能檢測到C21orf105和PLAC4 mRNA，而非妊娠婦女血漿中檢測不到，故二者有望用于21-三體綜合征的無創產前篩查。

對于離體血標本的存放溫度和處理時間，目前報道尚不統一，有將外周血標本離體后置于室溫下3 h[10]、6 h[11]、24 h[12]內處理；也有將血標本存放于4 ℃條件下72 h[4]內處理；Ng等[12]研究發現孕婦外周血離體后室溫放置24 h，hPL、hCG mRNA濃度無明顯改變。目前尚不明確是否血漿中所有的mRNA都具有較強的穩定性。因此，有必要研究存放溫度及處理時間對孕婦血漿中C21orf105、PLAC4 mRNA穩定性的影響。作者對此進行了探討，研究結果顯示，存放時間和溫度對孕婦血漿中C21orf105、PLAC4 mRNA水平無明顯影響,孕婦血漿中的胎兒游離C21orf105、PLAC4 mRNA具有極強的穩定性，同Ng等[3]的研究結論相一致。孕婦血漿中胎兒游離C21orf105、PLAC4 mRNA能在室溫中穩定存在72 h，且仍具有擴增能力，這種穩定性有利于對母體血漿中C21orf105、PLAC4 mRNA的檢測。

21-三體綜合征胎兒的胎盤發育發生改變，滋養層細胞凋亡增加，母胎界面細胞釋放增加[7]，理論上胎兒21-三體綜合征孕婦外周血中由21號染色體編碼的mRNA表達量高于正常胎兒孕婦，但是目前研究中，孕婦血漿C21orf105、PLAC4 mRNA表達量與胎兒21-三體綜合征的關系存在爭議。程蔚蔚等[6]研究發現胎兒21-三體綜合征孕婦血漿中C21orf105 mRNA水平明顯高于正常胎兒孕婦；但是Go等[4]的研究表明,21-三體綜合征胎兒孕婦與正常胎兒孕婦血漿中C21orf105 mRNA表達量并無顯著差異。2008年Banzola等[7]研究發現，與正常胎兒孕婦血漿中PLAC4 mRNA表達水平相比，21-三體綜合征胎兒孕婦血漿中PLAC4 mRNA表達水平沒有顯著改變；2010年Tsui等[8]應用real-time PCR法測定孕婦血漿中PLAC4 mRNA表達量，發現21-三體綜合征胎兒孕婦PLAC4 mRNA表達量明顯高于正常胎兒孕婦。該研究中，作者采用實時熒光定量RT-PCR方法，以β-actin為內參，檢測了38例21-三體綜合征胎兒孕婦及40例年齡、孕周相匹配的正常胎兒孕婦血漿中C21orf105、PLAC4 mRNA的表達量，結果顯示，21-三體綜合征胎兒孕婦血漿中C21orf105、PLAC4 mRNA表達量高于正常胎兒孕婦，提示孕婦外周血中C21orf105、PLAC4 mRNA檢測有望成為21-三體綜合征產前篩查的有效指標。

綜上所述，孕婦血漿中胎兒C21orf105、PLAC4 mRNA具有較強的穩定性，室溫中穩定存在72 h仍具有擴增能力。在以后的研究或臨床應用中，可以對在室溫中存放3 d的全血標本進行檢測，以便于基層醫院對標本的儲存及運送，實現一次性檢測更多的病例，可大大節約人力、物力，降低研究成本。母體血漿中C21orf105、PLAC4 mRNA可能成為21-三體綜合征產前篩查的有效指標。

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中圖分類號R714.5

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.02.016

*河南省基礎與前沿技術研究計劃項目132300410197