Fgl2基因過表達對自身免疫性心肌炎大鼠心功能的影響*

鄭振中，黃火明，梁　靜

南昌大學第一附屬醫院心血管內科 南昌330006

△男，1975 年8月生，博士，副教授，副主任醫師，研究方向：冠心病的防治和介入治療，E-mail：greateful@163.com

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Fgl2基因過表達對自身免疫性心肌炎大鼠心功能的影響*

鄭振中△，黃火明，梁靜

南昌大學第一附屬醫院心血管內科 南昌330006

△男，1975 年8月生，博士，副教授，副主任醫師，研究方向：冠心病的防治和介入治療，E-mail：greateful@163.com

關鍵詞纖維介素蛋白2；自身免疫性心肌炎；心功能；大鼠

摘要目的：建立慢病毒介導纖維介素蛋白2(Fgl2)基因過表達自身免疫性心肌炎(EAM)大鼠模型，探討Fgl2基因過表達對EAM大鼠心功能的影響。方法：32只雄性Lewis大鼠隨機分為正常對照組、EAM組、空載體自身免疫性心肌炎組(EAM-GFP組)和Fgl2 慢病毒過表達自身免疫性心肌炎組(EAM-Fgl2組)4組。在實驗第60天，對各組大鼠行心臟彩色多普勒檢查，檢測各組大鼠的左室短軸縮短率(LVFS)，計算左室射血分數(LVEF)，Western blot法檢測各組大鼠心肌組織中Fgl2蛋白表達情況，ELISA法檢測各組大鼠靜脈血腦鈉肽(BNP)水平。結果：4組心肌組織中Fgl2蛋白和靜脈血BNP表達的水平差異有統計學意義(P均<0.001)，EAM-Fgl2組Fgl2蛋白表達高于對照組、EAM組和EAM-GFP組；與其他3組比較，EAM-Fgl2組的LVFS和LVEF均降低，差異有統計學意義(P均<0.001)。 結論：慢病毒介導的Fgl2基因過表達載體能明顯上調EAM-Fgl2組心肌細胞中Fgl2蛋白的表達；且慢病毒介導的Fgl2基因過表達后可惡化EAM大鼠心功能。

Effects of Fgl2 gene over expression on heart function in autoimmune myocarditis rats

ZHENGZhenzhong，HUANGHuoming，LIANGJing

DepartmentofCardiology，theFirstAffiliatedHospital，NanchangUniversity，Nanchang330006

Key wordsfibrinogen-like protein 2;autoimmune myocarditis;heart function;rat

AbstractAim: To establish autoimmune myocarditis rat model and observe the effect of fibrinogen-like protein 2(Fgl2) gene overexpression on the heart function of autoimmune myocarditis. Methods: A total of 32 male Lewis rats were randomly allocated into EAM group, EAM-GFP group,EAM-Fgl2 group and control group.A lentiviral vector of Fgl2 gene was constructed.After myosin injection,a trans-thoracic echocardiographic analysis was performed on day 60,and LVFS and LVEF were measured. The expression of Fgl2 was measured by Western blot. BNP level was estimated with ELISA kit for BNP.Results: Compared with control group,EAM group and EAM-GFP group,the expressions of Fgl2 and BNP were significantly increased in EAM-Fgl2 group(P<0.001),while LVFS and LVEF were significantly decreased(P<0.001)．Conclusion: Fgl2 gene overexpression deteriorates the heart function of rats with EAM. Fgl2 is a potent target for the treatment of EAM.

研究[1-2]發現，纖維介素蛋白2(fibrinogen-like protein 2，Fgl2)是CD4+CD25+調節性T細胞(regulatory T cell，Treg)的效應分子，其抗體能夠完全阻斷Treg的活力，提示Fgl2是干預心肌自身免疫損傷的有效靶點。作者以前的研究[3-5]結果證實，Fgl2 基因沉默能夠促進心肌微血管內皮細胞(myocardial microvascular endothelial cells，MMVECs)的增殖和遷移，提示Fgl2 參與了血管新生的調控，其機制可能與上調血管生成素1、2的表達有關。實驗性自身免疫性心肌炎(experimental autoimmunity myocarditis，EAM)動物模型是研究自身免疫介導心肌損傷的有效工具，為了明確Fgl2基因在心肌自身免疫損傷中的作用，該研究建立了EAM大鼠模型，觀察Fgl2基因過表達對其心功能的影響。

1材料與方法

1.1材料與試劑HEK293T細胞購自中科院上海細胞所，重組病毒質粒及輔助包裝原件載體質粒購自上海吉凱基因化學公司，LipofectamineTM2000、Trizol試劑盒購自Invitrogen公司，反轉錄RNA 試劑盒購自Promega 公司，RNase-free購自Axygen 公司，Fgl2 單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，化學發光底物購自美國Thermo公司，BNP-ELISA試劑盒購自上海森科公司，載有Fgl2質粒的慢病毒構建和包裝及檢測由吉凱基因公司完成。

1.2建立動物模型和分組采用隨機數字表法將32只雄性Lewis大鼠(北京維通利華實驗動物技術有限公司)分為正常對照組、EAM組、EAM-GFP組[生理鹽水稀釋綠色熒光蛋白(GFP)轉染的慢病毒載體5×107IU/mL，在EAM誘導的第1天，以每只大鼠1 mL的劑量進行尾靜脈注射]和EAM-Fgl2組(冰浴法解凍-80 ℃存放的Fgl2過表達慢病毒載體后，生理鹽水稀釋至5×107IU/mL，以每只大鼠1 mL的劑量進行尾靜脈注射)，對后3組大鼠其進行EAM模型誘導，將純化豬心肌肌球蛋白溶于0.15 mol/L的PBS溶液中，控制其質量濃度為2 g/L，然后與完全弗氏佐劑等體積混合并完全乳化，使其成為均勻的乳濁液；按1 mL/只(即含肌球蛋白1 mg的劑量)在Lewis大鼠的雙側腹股溝、腋部皮下注射[6]。免疫時間為第1天和第8天，共2次。

1.3心臟彩色多普勒檢測心功能在實驗第60天，對各組大鼠進行心臟彩色多普勒檢查。每只大鼠禁食1 d后，剔去胸部鼠毛，腹腔注射20 g/L戊巴比妥麻醉，仰臥位固定，應用超聲心動圖(VIVID7型號，GE公司，美國)及10.0 MHz高頻線控探頭(GE公司，美國)進行超聲檢測。取胸骨旁左室長軸切面，M型超聲心動圖取樣線在腱索水平，測室腔的大小和室壁的厚度；取心底波群，測主動脈根部內徑和左房的大小。高頻線控探頭置于心尖部，取心尖四腔圖，取樣容積置于二尖瓣瓣口，獲得舒張期二尖瓣血流頻譜，均按照美國超聲醫學標準進行上述操作。連續儲存獲得的上述超聲圖像，然后再用實時、慢速回放及凍結圖像等技術對圖像進行分析處理。各測量數據均取5個心動周期的均值。測量指標:測量左室射血分數[LVEF=(EDV-ESV)/EDV]、左室短軸縮短率[LVFS=(LVDd-LVDs)/LVDd]。

1.4各組大鼠靜脈血腦鈉肽(brain natriuretic peptide，BNP)含量的ELISA法檢測在大鼠完成心功能檢測后，切開胸骨，暴露心臟，用注射器迅速從右房靜脈系統中抽取血5 mL血液，放入生化試管，置于2 ℃冰箱過夜后使其血清析出，將裝有血液的生化管均勻排列于離心機，以3 000 r/min的速度離心15 min，用1 mL注射器吸取上清液，然后放入凍存管中-80 ℃保存。試劑盒從冷藏環境中取出后室溫平衡30 min。制備標準品、加樣、溫育、配液、洗滌、加酶、溫育、洗滌、顯色：以空白孔調零，在450 nm波長處依序號測量各孔的吸光度值。加終止液，15 min內進行完上述測定。

1.5各組大鼠心肌組織中Fgl2蛋白表達的Western blot檢測心功能檢測完畢后處死動物，取部分心肌組織，在冰浴的裂解緩沖液中研碎成勻漿，4 ℃ 12 000g離心30 min，吸取上清。考馬斯亮藍法測定蛋白質濃度。每組取約40 μg蛋白質在120 g/L SDS-PAGE凝膠上電泳分離，4 ℃下電轉移至PVDF膜上。室溫下用含50 g/L的脫脂奶粉TBS-T溶液封閉。PVDF膜與抗體4 ℃孵育過夜，而后與辣根過氧化物酶偶聯的二抗室溫孵育2 h。用化學發光試劑盒按說明書要求顯影、曝光，并用凝膠成像分析系統灰度掃描來定量檢測蛋白質的相對表達量。各組數據均用相應GAPDH進行標準化處理。

1.6統計學處理采用SPSS 19.0進行分析，應用單因素方差分析和LSD-t檢驗比較4組大鼠心肌組織中Fgl2蛋白和靜脈血BNP水平以及左室心功能的變化，檢驗水準α=0.05。

2結果

2.1各組大鼠心肌組織中Fgl2蛋白表達的結果和靜脈血BNP水平的比較見表1。

表1　各組大鼠心肌組織中

*：與正常對照組相比，P<0.05；#：與EAM-GFP組和EAM組相比，P<0.05。

2.2各組大鼠左室心功能的變化見表2。

表2　各組大鼠左室心功能的變化

*：與正常對照組相比，P<0.05；#：與EAM組相比，P<0.05。

3討論

基礎和臨床的研究[7-8]都表明由心肌炎向心肌病發展主要是由進展性的自身免疫損傷造成的，因此，針對免疫損傷干預擴張型心肌病的發生發展是擴張型心肌病治療研究中的熱點問題之一。

Fgl2屬纖維蛋白原相關蛋白超家族，其主要的生物學活性類似于活化的凝血因Ⅹa，可直接催化凝血酶原轉變為凝血酶，繼而使纖維蛋白原轉變為纖維蛋白，從而快速啟動凝血，即免疫凝血[4]。Fgl2介導凝血酶原參與暴發性肝炎、自發性流產及同種和異種急性移植排斥反應[9-10]等病理過程，通過觸發炎癥/血栓形成，在局部高表達，啟動局部凝血過程，導致纖維蛋白沉積、微血栓形成、微循環障礙和局部炎癥反應，最終導致臟器形態學變化和功能障礙。

該研究結果顯示：慢病毒介導的Fgl2基因過表達可明顯上調其在EAM大鼠心肌細胞中的表達，增加BNP水平，惡化EAM大鼠模型左室心功能，但其詳細機制尚不清楚，是進一步研究的方向。

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中圖分類號Q782

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.02.012

*國家自然科學基金項目30960119，81260044；江西省科技支撐計劃項目2010BSA12000