氟病區(qū)成人雌激素受體α基因PvuⅡ多態(tài)性與骨組織異常的關(guān)系*

段雷振，楊躍進，周　桐，崔留欣，丁　中，李世宏，程學(xué)敏，趙明旭，周郭育，巴　月#

1)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院環(huán)境衛(wèi)生學(xué)教研室 鄭州 450001　2)開封市疾病預(yù)防控制中心地方病科 開封 475000

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氟病區(qū)成人雌激素受體α基因PvuⅡ多態(tài)性與骨組織異常的關(guān)系*

段雷振1)，楊躍進2)，周桐1)，崔留欣1)，丁中2)，李世宏2)，程學(xué)敏1)，趙明旭1)，周郭育1)，巴月1)#

1)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院環(huán)境衛(wèi)生學(xué)教研室 鄭州 4500012)開封市疾病預(yù)防控制中心地方病科 開封 475000

關(guān)鍵詞氟；雌激素受體；基因多態(tài)性；骨組織

摘要目的：探討雌激素受體(ER)α基因PvuⅡ多態(tài)性與氟暴露地區(qū)成人骨組織異常的關(guān)系。方法：采用整群抽樣方法，在氟病區(qū)及對照區(qū)選擇當?shù)爻錾蚓幼? a以上18～55歲的人群為觀察對象；采用PCR-RFLP法分析ERα基因PvuⅡ多態(tài)性；采用X線檢查兩區(qū)人群骨組織改變。結(jié)果：暴露組和對照組人群骨組織異常率分別為65.34%和40.32%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；以pp基因型為參照，暴露組攜帶Pp/PP人群骨組織異常的危險性增高(PR=1.087, 95%CI=1.053～1.437或PR=1.145, 95%CI=1.104～1.318)。結(jié)論：攜帶ERα PvuⅡPp/PP基因型可能增加骨組織對氟暴露敏感性。

ERα gene PvuⅡpolymorphism and bone tissue abnormalities in adults exposed to fluoride

DUANLeizhen1),YANGYuejin2),ZHOUTong1),CUILiuxin1),DINGZhong2),LIShihong2),CHENGXuemin1),ZHAOMingxu1),ZHOUGuoyu1),BAYue1)

1)DepartmentofEnvironmentalHealth,CollegeofPublicHealth,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001 2)DepartmentofEndemicDisease,KaifengCenterforDiseasePreventionandControl,Kaifeng475000

Key wordsfluoride;estrogen receptor;gene polymorphism;bone tissue

AbstractAim: To explore the relationship between estrogen receptor α(ERα) gene polymorphism and bone tissue abnormalities in adults exposed to fluoride in drinking water.Methods: Adults aged from 18 to 55 years old who were born and grew or lived there for at least 5 years in endemic fluorosis villages or control villages were recruited using cluster sampling. They were allocated into endemic fluorosis group and control group in accordance with the above areas. PCR-RFLP was used to determine PvuⅡ genotype in ERα gene. X-ray was used to detect changes of the subjects′ bone tissue of the two groups.Results: The abnormal rate of bone tissue in endemic fluorosis group(65.34%) were significantly higher than that in control group(40.32%)(P<0.05). The increased risk of bone tissue abnormalities was observed in subjects carrying Pp/PP genotype of ERα gene compared with subjects carrying pp genotype from endemic fluorosis group(PR=1.087,95%CI=1.053-1.437;PR=1.145,95%CI=1.104-1.318).Conclusion: Bone tissue in people who carried ERα PvuⅡ Pp/PP genotype may be more susceptible to fluoride exposure.

氟斑牙和氟骨癥是地方性氟中毒的特征性臨床表現(xiàn)。骨密度受遺傳因素和環(huán)境因素的共同影響[1-2]。研究[3]發(fā)現(xiàn)，雌激素受體(estrogen receptor,ER)基因突變可導(dǎo)致骨密度明顯下降，過量氟攝入亦可造成骨質(zhì)疏松、骨質(zhì)硬化等骨相損傷。但目前為止，有關(guān)氟暴露與ERα基因多態(tài)性交互作用對骨組織改變的影響尚未闡明。該研究通過現(xiàn)況調(diào)查，應(yīng)用X線檢查暴露組人群骨組織變化，并運用限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)檢測ERα基因PvuⅡ多態(tài)性，以探討氟暴露人群ERα基因PvuⅡ多態(tài)性與骨組織異常之間的關(guān)系。

1對象與方法

1.1調(diào)查點及調(diào)查對象的選擇

1.1.1調(diào)查點的選擇在準確監(jiān)測水氟含量的基礎(chǔ)上，選擇河南省某縣的5個村莊作為調(diào)查點，根據(jù)水氟濃度將5個村分為高氟區(qū)(水氟濃度2.44±1.88 mg/L)和對照區(qū)(水氟濃度0.37±0.15 mg/L)。除水氟濃度外，調(diào)查地區(qū)經(jīng)濟水平、自然條件、農(nóng)作物種類、生活習慣、人口構(gòu)成等均一致，且均無工業(yè)氟污染，調(diào)查區(qū)內(nèi)其他環(huán)境介質(zhì)氟水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義[4]。

1.1.2調(diào)查對象的選擇選取調(diào)查地區(qū)出生成長或居住5 a以上的18～55歲成人為調(diào)查對象。排除有骨代謝疾病和3個月內(nèi)服用任何影響骨代謝藥物者，包括甲狀腺和甲狀旁腺功能改變、Cushing綜合征、慢性肝腎疾病和骨關(guān)節(jié)病者等，以及服用雌激素、降鈣素、鈣制劑及甲狀腺激素者等。在滿足上述條件人群中選擇238例，其中對照區(qū)62人為對照組，高氟區(qū)176人為暴露組，對其進行健康體檢、骨骼X線檢查并抽取空腹外周靜脈血。

1.2生物樣本的采集研究對象于調(diào)查前日晚10點禁食，次日晨起抽取空腹外周靜脈血10 mL(抗凝及非抗凝各5 mL)于-80 ℃低溫保存，用于基因組DNA提取和ERα PvuⅡ多態(tài)性分析。

1.3骨組織異常情況檢查及結(jié)果判定依照中國地方病防治辦公室頒布的地方性氟中毒X線診斷標準，分別對前臂(包括肘關(guān)節(jié)及腕關(guān)節(jié))、小腿(包括膝關(guān)節(jié))及骨盆拍正位片，重點觀察骨質(zhì)、骨周和關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的改變。X線檢查結(jié)果由影像專業(yè)醫(yī)師判定，骨組織異常主要包括骨質(zhì)疏松、骨質(zhì)硬化、骨周軟組織硬化、骨結(jié)構(gòu)改變等。

1.4ERα PvuⅡ基因分型

1.4.1全血基因組DNA提取采用全血基因組抽提試劑盒(Axygen Biosciences,美國)提取基因組DNA。

1.4.2ERα PvuⅡ多態(tài)性分析參照相關(guān)文獻[5]設(shè)計PCR擴增引物，并由上海博尚生物公司合成。上游引物：5’-CTGCCACCCTATCTGTATCTTTTC CTATTCTCC-3’，下游引物：5’-TCTTTCTCTGCCAC CCTGGCGTCGATTATCTGA-3’，產(chǎn)物大小1 300 bp。PCR體系為25 μL，其中基因組DNA 100 ng、2×Taq Master Mix 12.5 μL(康為世紀，北京)、ddH2O 6.5 μL、上和下游引物濃度為250 nmol/L。PCR擴增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性20 s、60 ℃退火30 s、72 ℃ 30 s延伸，共 35個循環(huán)；72 ℃末端延伸5 min。PCR-RFLP反應(yīng)體系為30 μL，其中PCR產(chǎn)物10.0 μL、PvuⅡ內(nèi)切酶1.0 μL(MBI Fermentas，立陶宛)、10×Buffer Tango 2 μL、ddH2O 17 μL，37 ℃酶切4 h。PCR產(chǎn)物經(jīng)PvuⅡ酶切后，置15 g/L瓊脂糖電泳，紫外燈下，存在PvuⅡ酶切位點的純合子(pp)顯示800 bp和500 bp兩條帶；缺乏PvuⅡ酶切位點的純合子(PP)顯示1 300 bp一條帶；雜合子(Pp)顯示上述三條帶。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理采用EpiData 2.0建立數(shù)據(jù)庫，以雙人雙機獨立錄入方式對問卷數(shù)據(jù)及測定結(jié)果錄入。數(shù)據(jù)分析采用SPSS 12.0。基因多態(tài)性分析以Hardy-Weinberg平衡吻合度檢驗確定對照組遺傳平衡狀況。ERα PvuⅡ各基因型在不同性別人群中的分布分析采用χ2檢驗。兩組人群骨組織異常率、ERα PvuⅡ不同基因型人群骨組織異常率比較采用log-binomial。采用logistic回歸分析氟暴露與ERα基因PvuⅡ多態(tài)性交互作用對骨組織改變的影響。檢驗水準α=0.05。

2結(jié)果

2.1兩組人群基本情況比較結(jié)果見表1。2組人群年齡分布、吸煙及飲酒狀況差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。無論男性和女性，暴露組人群尿氟水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，對照組人群ERα PvuⅡ基因型分布符合遺傳平衡(χ2=1.196,P=0.274)。

表1　兩組人群基本情況比較

2.2兩組人群骨組織異常情況比較結(jié)果見表2，暴露組骨組織異常率明顯高于對照組，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義，校正年齡及性別因素后，暴露組人群骨組織異常的危險性增加。

表2　兩組人群骨組織異常情況比較

*：以年齡、性別為校正因素。

2.3ERα PvuⅡ基因多態(tài)性與骨組織異常關(guān)系

2.3.1兩組人群ERα PvuⅡ3種基因型的分布結(jié)果見表3。ERα PvuⅡ基因型在兩組不同性別人群中分布的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表3　兩組不同性別

2.3.2攜帶ERα PvuⅡ不同基因型人群骨組織異常率比較見表4。由表4可知，校正年齡、性別及尿氟濃度后，暴露組攜帶Pp及PP基因型個體骨組織異常率明顯高于攜帶pp基因型個體。

2.3.3氟暴露與ERα基因PvuⅡ多態(tài)性交互作用對骨組織的影響見表5。校正年齡、性別及尿氟水平后，氟暴露與ERα基因PvuⅡ多態(tài)性不存在交互作用。

表4　攜帶ERα PvuⅡ不同基因型人群骨組織異常率比較

*:以年齡、性別及尿氟濃度為校正因素。

表5　 氟暴露與ERα基因

*：以年齡、性別及尿氟為校正因素。

3討論

3.1氟暴露對人群骨組織的影響該研究結(jié)果顯示，暴露組人群骨組織異常率明顯高于對照組人群，在校正了年齡及性別因素后，暴露組人群骨組織異常的危險性較對照組增加，提示即使在水氟濃度較低的輕病區(qū)，長期暴露亦可導(dǎo)致骨質(zhì)疏松、骨質(zhì)硬化、骨周軟組織硬化、骨結(jié)構(gòu)改變等骨組織異常率增加，與以往研究結(jié)果一致[6]。

3.2ERα PvuⅡ基因多態(tài)性與骨組織異常關(guān)系該研究選擇漢族成年人群[7]為研究對象，結(jié)果顯示ERα PvuⅡ基因型在不同地區(qū)、不同性別人群中的分布一致。在調(diào)整年齡、性別及尿氟濃度后，以pp基因型為參照，在氟暴露情況下攜帶Pp和PP基因型骨組織異常的危險性分別增加了9%和15%，提示攜帶Pp/PP基因型個體比攜帶pp基因型個體對氟暴露更為敏感，可能更容易發(fā)生骨質(zhì)疏松、骨質(zhì)硬化等骨組織異常改變。以往有關(guān)ERα基因PvuⅡ多態(tài)性對女性骨密度的影響研究結(jié)果不盡一致；Jeedigunta等[8]研究表明，攜帶pp基因型個體的骨密度明顯較PP基因型低；而Kobayashi等[9]研究表明，攜帶pp基因型女性骨密度較攜帶Pp或PP基因型女性骨密度高。鑒于機體對環(huán)境暴露的易感性不同，該研究就氟暴露與ERα基因PvuⅡ多態(tài)性交互作用對骨組織異常的影響進行了分析。未觀察到氟暴露與ERα基因PvuⅡ多態(tài)性存在交互作用。由于機體骨代謝受多種因素影響。因此，從基因水平探索氟暴露與骨組織異常的關(guān)系，應(yīng)進一步擴大樣本量，從多基因、多因素的角度深入研究。

致謝：感謝參與課題現(xiàn)場調(diào)查工作的鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院、開封市疾病預(yù)防控制中心及通許縣疾病預(yù)防控制中心地方病科的工作人員；感謝所有參與此項研究的調(diào)查對象。

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中圖分類號R599

#通信作者，女，1963年7月生，博士，教授，研究方向：環(huán)境相關(guān)疾病分子發(fā)病機制，E-mail:byyue@zzu.edu.cn

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.02.010

*國家自然科學(xué)基金資助項目81072247；河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點項目13A330653