5-羥色胺對腸炎小鼠結腸組織中GRP78表達的影響*

陳夢露，董仕楨，常永超，陳　攀，馮丹丹，高　強#

1)河南科技大學第一附屬醫院(河南科技大學臨床醫學院)消化內科 洛陽 471003　2)河南科技大學第一附屬醫院(河南科技大學臨床醫學院)檢驗科 洛陽 471003

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5-羥色胺對腸炎小鼠結腸組織中GRP78表達的影響*

陳夢露1,2)，董仕楨1,2)，常永超2)，陳攀1)，馮丹丹1)，高強1)#

1)河南科技大學第一附屬醫院(河南科技大學臨床醫學院)消化內科 洛陽 4710032)河南科技大學第一附屬醫院(河南科技大學臨床醫學院)檢驗科 洛陽 471003

關鍵詞5-羥色胺；炎癥性腸病；葡萄糖調節蛋白78；小鼠

摘要目的：觀察5-羥色胺(5-HT)對腸炎小鼠結腸組織葡萄糖調節蛋白78(GRP78)表達的影響。方法：將7～8周齡的C57BL/6小鼠隨機分為6組(n=8)：正常對照組，低、高劑量5-HT組(分別給予1.0、2.0 mg/kg的5-HT灌腸,每3 d 1次)，低、高劑量DSS組(分別飲用10或25 g/L DSS溶液)，DSS+5-HT組(給予10 g/L DSS+1.0 mg/kg 5-HT)，于第6天結束時處死小鼠。通過疾病活動指數評分、結腸長度測定和HE染色等方法評估腸道炎癥程度，采用實時定量PCR技術檢測小鼠結腸組織中IL-6、TNF-α和 GRP78 mRNA的表達水平，采用免疫組化法檢測小鼠結腸組織中GRP78蛋白的表達。結果：正常對照組，低、高劑量5-HT組小鼠無腸炎，低劑量DSS組有輕微腸炎，高劑量DSS組和DSS+5-HT組有嚴重腸炎。IL-6和TNF-α mRNA的表達水平隨炎癥程度而增加。GRP78 mRNA和蛋白在正常對照組、低劑量5-HT組和低劑量DSS組中的表達水平差異無統計學意義(P>0.05)，在高劑量5-HT組、DSS+5-HT組和高劑量DSS組，尤其是高劑量DSS組表達增高(P<0.05)。結論：5-HT可能通過上調GRP78蛋白的表達激活內質網應激反應，參與腸道炎癥反應。

Effects of 5-hydroxytryptamine on expression of GRP78 in colon tissue of mice with colitis

CHENMenglu1,2),DONGShizhen1,2),CHANGYongchao2),CHENPan1),FENGDandan1),GAOQiang1)

1)DepartmentofGastroenterologyandHepatology,theFirstAffiliatedHospitalandCollegeofClinicalMedicineofHenanUniversityofScienceandTechnology,Luoyang4710032)DepartmentofClinicalLaboratory,theFirstAffiliatedHospitalandCollegeofClinicalMedicineofHenanUniversityofScienceandTechnology,Luoyang471003

Key words5-hydroxytryptamine;inflammatory bowel disease;glucose regulated protein 78;mouse

AbstractAim: To investigate the impact of 5-hydroxytryptamine(5-HT) on the expression of endoplasmic reticulum stress chaperone glucose regulated protein 78(GRP78) in mouse inflammatory colon induced by dextran sulfate sodium (DSS). Methods: Seven to eight-week-old C57BL/6 mice were randomly allocated into 6 groups(n=8). Mice in normal control group drank water freely. Mice in low-dose 5-HT and high-dose 5-HT groups received 1.0 mg/kg and 2.0 mg/kg of 5-HT by enema respectively. Mice in low-dose DSS and high-dose DSS groups received 10 and 25 g/L DSS solution, respectively. Mice in DSS+5-HT group were concurrently treated with 10 g/L DSS solution and 1.0 mg/kg of 5-HT. At the end of the 6th day, they were scarified to gather specimens. The severity of colitis was evaluated by disease activity index(DAI), colon length and pathological inflammatory scores of colon. Inflammatory cytokines such as IL-6 and TNF-α mRNA expressions in colon tissue were measured by quantitative real-time PCR. The protein and mRNA expressions of GRP78 in colon tissue of mice were evaluated by immunohistochemistry and RT-PCR,respectively. Results: There was no colitis in mice of normal control, low-dose 5-HT and high-dose 5-HT groups, while mild colitis was found in mice of low-dose DSS group. However, mice co-treated with DSS and 5-HT had severe colitis, which was comparable to mice treated with high-dose DSS. In addition, the expressions of IL-6 and TNF-α mRNA increased with the deterioration of inflammatory degree. The mRNA and protein expressions of GRP78 in normal control, low-dose 5-HT and low-dose DSS groups was similar, while in high-dose 5-HT,DSS+5-HT and high-dose DSS groups, especially the high-dose DSS group were upregulated(P<0.05).Conclusion: 5-HT may activate endoplasmic reticulum stress response by increasing the expression of GRP78 protein, and participate in intestinal inflammation.

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)是一種慢性非特異性腸道炎癥性疾病，包括克羅恩病(Crohn's disease,CD)和潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis,UC)兩種類型。IBD的確切病因尚未明確，目前普遍認為是遺傳、免疫、腸道菌群和環境等多種因素相互作用的結果[1]。內質網應激是指在細胞內能量水平、氧化狀態或鈣離子濃度異常等情況下內質網功能發生改變，它在IBD發生和發展中的作用越來越受到重視[2]。葡萄糖調節蛋白78(glucose regulated protein 78，GRP78)是內質網應激誘導表達的關鍵蛋白，在蛋白質折疊、調節內質網應激跨膜信號蛋白活性等方面發揮著重要作用[3]。炎癥發生時，細胞促炎因子及趨化因子如IL-1β、IL-8、IL-6、TNF-α及IFN-γ增加，促進炎癥的發生發展。5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)在中樞神經系統中作為一種神經遞質而起作用，然而體內大多數(約90%)5-HT存在于腸道，5-HT通過激活一系列受體調控許多胃腸道功能，包括分泌和蠕動[4]。在IBD中，5-HT信號系統異常導致胃腸道動力及分泌功能異常和內臟高敏性[5]。在CD患者和IBD動物模型中均發現有炎癥的腸黏膜組織中5-HT水平上升[6]。該研究中作者采用葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium，DSS)誘導建立小鼠腸炎模型，觀察5-HT對腸炎小鼠結腸組織GRP78 mRNA和蛋白的表達以及炎癥因子mRNA水平的影響，探討5-HT在DSS誘導小鼠腸炎過程中所發揮的作用。

1材料與方法

1.1材料實驗動物：健康清潔級C57BL/6小鼠(購于北京維通利華公司)，7～8周齡，雄性，體重20～25 g，飼養于河南科技大學第一附屬醫院新區醫院實驗動物中心，用混合配方顆粒飼料(北京華阜康生物科技股份有限公司)飼養。DSS(相對分子質量為 36 000～50 000，美國MP Biomedicals 公司)，5-HT(德國Sigma公司)，戊巴比妥鈉(德國Merck公司)。總RNA提取試劑由Invitrogen公司生產，反轉錄試劑盒和實時熒光定量PCR試劑盒購于TaKaRa公司，免疫組化檢測用GRP78一抗購于英國Abcam公司，SABC免疫組化檢測試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司，濃縮型DAB顯色試劑盒購于北京索萊寶公司。

1.2實驗分組和取材小鼠適應性喂養1周，室內溫度保持在20～22 ℃，濕度約50%，明暗交替周期為12 h，隨機分為6組，每組8只。建模前所有小鼠禁食24 h，正常對照組自由飲水，低、高劑量5-HT組分別給予1.0和2.0 mg/kg的5-HT灌腸，低、高劑量DSS組分別飲用10或25 g/L DSS溶液，DSS+5-HT組給予10 g/L DSS溶液加1.0 mg/kg 5-HT；5-HT通過灌腸的方式給藥，每3 d 1次，其他組灌注生理鹽水，于第6天各組均飲用蒸餾水[7]。于造模第6天結束時脫頸處死所有小鼠，打開腹腔，取全結腸，翻轉結腸后，PBS漂洗，自遠端結腸始取約0.5 cm，體積分數4.0%的甲醛溶液固定，石蠟包埋，4.0 μm厚切片，以備HE和免疫組化染色使用。再取1.0 cm，-80 ℃保存，以備mRNA的測定。

1.3觀察指標①每日定時測量小鼠體重、觀察小鼠攝食/飲水、活動度、大便性狀、便血等狀態，參照Jackson等[8]的方法進行疾病活動指數(disease activity index，DAI)評分。取材時測量全結腸長度，肉眼觀察結腸內血性內容物情況。參照張靜等[9]的方法進行血便評分。②采用HE染色法對結腸組織進行病理分析。在400倍鏡下進行細胞計數，每張切片選擇10個視野，每個視野觀察100個細胞。根據Esworthy等[10]的評分標準進行評分，急性炎癥的臨界值定為6分。

1.4各組小鼠結腸組織IL-6、TNF-α和GRP78 mRNA表達水平的檢測Trizol法提取總RNA，測定RNA純度和濃度后取2 μg，反轉錄合成cDNA，-20 ℃保存備用。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成(表1)。冰上配制PCR反應液，反應體系25 μL：cDNA 2 μL，SYBR Premix EX TaqⅡ(2×)12.5 μL，DEPC水8.5 μL，上、下游引物各1.0 μL(濃度10 μmol/L)。于BIO-RAD Real-time PCR儀中進行PCR反應，反應條件為：95 ℃預變性30 s，95 ℃ 5 s；分別58 ℃、60 ℃和56 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s，共40個循環。每個樣本3個復孔，取均值，以β-actin為內參，采用2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達量。

表1　引物序列

1.6統計學處理采用SPSS 19.0處理數據，各組小鼠第6天DAI和血便評分的比較采用秩和檢驗，其他指標的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2結果

2.1各組小鼠一般情況觀察、DAI評分及血便評分比較正常對照組、低劑量5-HT組和高劑量5-HT組小鼠每天攝食和飲水正常，活動如常，反應機警，皮毛有光澤，生長發育良好，體重增加；低劑量DSS組于造模第5天出現懶動，攝食/飲水減少，體重下降，出現稀便、肛周潮濕現象，第6天有3只出現血水樣便，但體重下降均未超過10%；DSS+5-HT組和高劑量DSS組都于造模第4天開始相繼出現懶動、精神萎靡，體毛凌亂，攝食/飲水減少，并出現稀便、肉眼血便、肛周潮濕現象，體重下降。DSS+5-HT組第6天有7只出現嚴重肉眼血便，6只體重下降超過10%，但無小鼠死亡。高劑量DSS組第6天有7只出現嚴重肉眼血便；有1只小鼠死亡，剩余7只體重下降均超過10%。各組小鼠第6天DAI和血便評分的比較見表2。

2.2各組小鼠病理觀察結果各組小鼠結腸長度和炎癥病理評分比較見表2。造模結束后，與正常對照組相比，低劑量DSS組、DSS+5-HT組和高劑量DSS組結腸長度均有不同程度的縮短，其中DSS+5-HT組和高劑量DSS組縮短最嚴重。正常對照組、低劑量5-HT組和高劑量5-HT組小鼠結腸黏膜結構完整，無炎性細胞浸潤；低劑量DSS組黏膜腺體基本完整，局部有少量炎性細胞浸潤或隱窩破壞，呈輕度炎癥改變；DSS+5-HT組和高劑量DSS組均可見黏膜上皮細胞廣泛缺失，腺體大多數不完整，細胞結構排列紊亂，杯狀細胞消失，中性粒細胞等炎癥細胞浸潤廣泛，呈嚴重炎癥改變(圖1)。

表2　各組小鼠第6天DAI、

*:與正常對照組相比,P<0.05;#:與低劑量DSS組相比,P<0.05；△：與低劑量5-HT組相比，P<0.05。

2.3各組小鼠結腸組織中IL-6、TNF-α和GRP78 mRNA的表達見表3。

2.4各組小鼠結腸組織中GRP78蛋白的表達GRP78蛋白主要表達于結腸上皮細胞胞質，少量分布于胞膜。GRP78蛋白在正常對照組、低劑量5-HT組和低劑量 DSS組的表達均較少，高劑量5-HT組和DSS+5-HT組表達上調，高劑量DSS組最高。見圖2、表3。

表3　各組小鼠結腸組織中

*:與正常對照組相比,P<0.05;#:與低劑量DSS組相比,P<0.05；△：與低劑量5-HT組相比，P<0.05。

A：正常對照組；B：低劑量5-HT組；C：高劑量5-HT組；D：低劑量DSS組；E：DSS+5-HT組；F：高劑量DSS組。圖1　各組小鼠結腸組織學表現(HE，×200)

A：正常對照組；B：低劑量5-HT組；C：高劑量5-HT組；D：低劑量DSS組；E：DSS+5-HT組；F：高劑量DSS組。圖2　各組小鼠GRP78蛋白的免疫組化染色(SABC,×200)

3討論

IBD在西方國家屬于常見病，在我國尚無普通人群的流行病學資料。研究[11]表明我國IBD的總報道病例數量在近十余年內增加了2.5倍，尤其是CD增加了15.7倍。臨床上，IBD患者除了存在一般消化道癥狀外，還可出現腸道梗阻、穿孔等并發癥以及腸道外癥狀，病程反復發作，遷延不愈。該實驗成功建立了小鼠腸炎模型，其腸炎與人類UC有類似的癥狀，如體重下降、腹瀉、血便等，病理表現為黏膜結構缺失，腺體變形萎縮，黏膜及黏膜下層以炎癥細胞浸潤為主，IL-6和TNF-α炎癥因子的表達升高。

Khan等[12]發現在CD和UC患者體內EC細胞數量和5-HT水平會產生變化。Shajib等[6]發現實驗性結腸炎模型中5-HT水平下降時，促炎因子水平降低，恢復 5-HT水平會增加DSS誘導的結腸炎的嚴重性。Regmi等[13]發現5-HT通過NADPH氧化酶Nox2調節腸黏膜的先天免疫反應。該研究發現單獨使用低或高劑量的5-HT時小鼠無腸炎表現，單獨使用低劑量DSS可誘導小鼠輕微腸炎改變，但低劑量DSS與低劑量5-HT合用則可引起與高劑量DSS相似的重度急性炎癥改變，提示5-HT單獨應用并不誘導小鼠明顯的腸炎變化，但與DSS聯合使用則有加重腸炎的作用。急性炎癥時，5-HT促進炎癥細胞的聚集，并促使巨噬細胞以激活NF-κB依賴的方式產生細胞因子，如IL-6[14]。該實驗發現高劑量5-HT組IL-6 mRNA水平明顯升高，提示5-HT參與炎癥的形成。樹突狀細胞(dendritic cell，DC)是體內激活初始T細胞的專職抗原呈遞細胞。EC細胞定位于DC附近，并且研究[15]發現5-HT在免疫調控中起著重要作用，反過來，免疫調節也改變EC細胞/5-HT信號。因此，5-HT信號和免疫反應的相互作用在引起IBD的發病機制中可能起著重要作用。

GRP78是內質網應激中重要的分子伴侶，在內質網中參與阻止內質網新生肽聚集、調節內質網鈣穩態、抗內質網相關性細胞凋亡，以及啟動未折疊蛋白反應等細胞生命過程[16]。生理條件下內質網應激對DC分化發育及存活具有至關重要的意義[17]。研究[18]發現衣霉素刺激可誘導DC中的內質網應激，內質網應激標志性分子GRP78蛋白表達水平明顯升高。該研究結果顯示GRP78蛋白和mRNA表達一致，正常結腸組織中GRP78表達較少，然而，隨炎癥程度的加重而表達增多，可能與炎癥時誘導內質網應激反應，激活GRP78有關。GRP78在高濃度5-HT組中表達上調，提示5-HT刺激可能通過腸上皮細胞以及炎癥細胞的5-HT受體，引起GRP78蛋白表達上調，激活內質網應激反應，進一步加重腸道炎癥反應。

總之，該研究結果提示5-HT參與結腸組織炎癥的發生發展；5-HT上調GRP78表達而影響腸道黏膜內質網應激。有關5-HT和GRP78之間具體的調控通路和作用機制還有待于進一步研究，以期為IBD的治療找到新的靶點。

致謝：感謝姜雅琳、李宏謙、楊茉莉和李小珍在實驗中給予的大力幫助。

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中圖分類號R574.6

#通信作者，男，1961年8 月生，博士，主任醫師，研究方向：消化道炎癥和腫瘤，E-mail：gaoq@mail.haust.edu.cn

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.02.008

*國家自然科學基金面上項目81370487