紅景天苷體外灌流對大鼠心肌細胞膜鈉通道電流的影響

黃媛恒，謝劍，黃創明，韋仙琴，林心媚，劉芳銘，李映新

(1廣西醫科大學基礎醫學院，南寧 530021；2廣西醫科大學藥學院)

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紅景天苷體外灌流對大鼠心肌細胞膜鈉通道電流的影響

黃媛恒1，謝劍1，黃創明1，韋仙琴1，林心媚1，劉芳銘1，李映新2

(1廣西醫科大學基礎醫學院，南寧 530021；2廣西醫科大學藥學院)

摘要：目的觀察紅景天苷體外灌流對SD大鼠心肌細胞膜鈉通道電流(INa)的影響。方法 SD大鼠頸部脫臼處死后，開胸剪斷主動脈并取下心臟，采用Langendorff 逆行主動脈灌流法急性分離SD大鼠單個心室肌細胞，置于培養皿，以電極外液灌流沖洗。置入微電極，充灌電極內液，采用全細胞模式的膜片鉗技術檢測INa，電流穩定后灌注紅景天苷100 μmol/L，再次檢測INa。繪制電流-電壓關系(I-V)曲線、穩態激活曲線及穩態失活曲線，觀察灌流前后大鼠心肌細胞INa及相關曲線的變化。結果紅景天苷灌流后INa幅值增加。紅景天苷灌流后INa I-V曲線下移，但不改變I-V曲線形狀、最大激活電位和反轉電位。紅景天苷灌流前后INa密度最大峰值分別為(-29.71±4.37)、(-58.66±8.21)pA/pF，灌流前后相比，P<0.05。紅景天苷灌流前后INa穩態失活曲線的半數失活電壓分別為(-66.67±1.57)、(-61.45±1.57)mV，半數失活電壓向正值方向移動，斜率因子分別為-10.23±1.30、-7.71±1.12，灌流前后半數失活電壓相比，P<0.05。紅景天苷灌流前后INa穩態激活曲線半數激活電壓差異無統計學意義。結論 紅景天苷體外灌流可使SD大鼠心肌細胞膜INa的I-V曲線下移，增加電流幅值，該作用可能與紅景天苷增加鈉通道失活電位、抑制電流失活有關。

關鍵詞：紅景天苷；心肌細胞；細胞膜離子通道；鈉通道；鈉通道電流；全細胞膜片鉗技術；動物實驗

紅景天是景天科景天屬多年生草本植物，有益氣活血、通脈止痛功效[1]，其主要活性成分為紅景天苷。研究[2~8]發現，紅景天苷具有抗氧化應激、改善微循環、增加缺血-再灌注心臟冠脈血流量、增強心肌收縮力、抗心律失常、改善缺血心肌功能等多種作用。心肌細胞電生理異常是心肌缺血-再灌注損傷及再灌注后心律失常發生的分子機制之一。紅景天苷可抑制心肌缺血損傷后動作電位幅度下降，推測此作用與鈉通道電流(INa)的增加有關，但尚未經實驗證實。2015年1~8月，我們分離大鼠心肌細胞，體外給予紅景天苷灌流，觀察灌流前后INa變化，現報告如下。

1材料與方法

1.1實驗動物與材料SPF級SD大鼠6只，雌雄不限，體質量(200±20)g，由廣西醫科大學實驗動物中心提供。紅景天苷(上海源葉生物科技有限公司，批號20131121，HPLC≥98%)，Ⅱ型膠原酶、MgAIP、EGTA(Sigma公司)，BSA(Gibico公司)(Sigma公司)，HEPES(Amresco公司)，其余試劑為國產分析純。無鈣臺氏液(mmol/L)：NaCl 136，KCl 5.4，MgC12·6H2O 1.0，NaH2PO4·2H2O 0.33，HEPES 10，Glucose 10，用NaOH調至pH 7.4。消化液為含Ⅱ型膠原酶10 mg、BSA 10 mg的無鈣臺氏液(30 mL)。KB液(mmol/L)：KOH 70，KCl 40，KH2PO420，MgC12·6H2O 3.0，HEPES 10，Tauringe 20，EGTA 0.5，L-glutamic acid 50，Glucose 10，用KOH調至pH 7.4。電極外液(mmol/L)：NaCl 20， CsCl 120，MgCl21，CaCl20.5，Glucose 10，HEPES 10，用CsOH調至pH 7.4；電極內液(mmol/L)：NaCl 5， CsCl 20，CsF 110，MgCl21，HEPES 5，EGTA 5，MgATP 5，用CsOH調至pH 7.2。EPC10放大器(HEKA公司)，P-97拉制儀(Sutter公司)，玻璃電極(武漢微探科學儀器有限公司)。

1.2心肌細胞分離大鼠頸部脫臼處死，迅速開胸，剪斷主動脈并取下心臟，按主動脈逆行插管將心臟掛于Langendorff裝置灌流，流速8 mL/min，灌流液持續通氧并保持出口處37 ℃恒溫。以無鈣臺氏液灌流至流出液澄清，再用消化液灌流至心臟松軟，即刻剪取心室部分組織于KB液中吹打并過200目篩網，過濾液自然沉降后棄上清液，加入新鮮KB液復懸，于-4 ℃冰箱保存，用于膜片鉗實驗。

1.3紅景天苷灌流方法及心肌INa檢測吸取心肌細胞懸液于培養皿中靜置，待細胞貼壁后，用電極外液灌流沖洗5 min，流速1.5 mL/min。微電極經拉制儀三步拉制而得，充灌電極內液后電阻為2~5 MΩ，采用全細胞模式的膜片鉗技術記錄INa。采用保持電位為-90 mV、指令電壓為-120~+25 mV、時程為50 ms、階躍為5 mV的刺激程序引出一內向電流，該電流能被30 μmol/L河豚毒素阻斷，證實為INa。待電流穩定后，以相同流速轉換含100 μmol/L紅景天苷的電極外液灌流沖洗細胞5 min。通過Pulsefit軟件進行數據轉換輸出。

1.4INa相關曲線的繪制分別于紅景天苷灌流前后繪制相關曲線。①采用Sigmaplot軟件繪制電流-電壓關系(I-V)曲線。②穩態激活曲線由I-V曲線數據轉換成膜電導并作圖獲得；用Boltzmann方程G/Gmax=1/{1+exp[-(V-V1/2)/k]}對曲線進行擬合，其中G為各個電壓下的膜電導，Gmax為最大膜電導，V1/2為半數激活電壓，k為斜率因子。③由雙脈沖刺激獲得穩態失活曲線；雙脈沖刺激參數：保持電位-90 mV，先給-120~+30 mV、階躍為10 mV、時程為50 ms的條件脈沖，然后緊跟一去極化至10 mV、持續時間10 ms的測試脈沖；用Boltzmann方程I/Imax=1/{1+exp[(V-V1/2)/k]}對激活曲線進行擬合，其中I為測試脈沖引出峰電流值，V1/2為半數失活電壓，k為斜率因子。

2結果

2.1紅景天苷灌流前后大鼠心肌細胞INa及I-V曲線變化紅景天苷灌流后INa幅值增加。紅景天苷灌流后INa I-V曲線下移，但不改變I-V曲線形狀、最大激活電位和反轉電位。灌流前INa的電流密度在膜電位-40 mV達到最大峰值[(-29.71±4.37)pA/pF]，灌流后電流密度最大峰值為(-58.66±8.21)pA/pF，灌流前后電流密度最大峰值相比，P<0.05。見圖1。

2.2紅景天苷灌流前后大鼠心肌細胞INa穩態激活曲線變化紅景天苷灌流前后INa穩態激活曲線V1/2分別為(-54.90±0.18)、(-53.66±0.21)mV，k分別為2.30±0.17、2.84±0.19，灌流前后V1/2相比，P>0.05。見圖2。

圖1　紅景天苷灌流前后INa I-V曲線變化

圖2　紅景天苷灌流前后INa穩態激活曲線變化

2.3紅景天苷灌流前后大鼠心肌細胞INa穩態失活曲線變化紅景天苷灌流前后INa穩態失活曲線V1/2分別為(-66.67±1.57)、(-61.45±1.57)mV，V1/2向正值方向移動，k分別為-10.23±1.30、-7.71±1.12，灌流前后V1/2相比，P<0.05。

圖3　紅景天苷灌流前后INa穩態失活曲線變化

3討論

缺血-再灌注損傷可使心肌細胞各種離子通道和離子交換體的功能平衡被打破，導致心肌細胞離子濃度和能量失衡，刺激心室結構重塑和功能改變[9]。研究[10]發現，大鼠心肌細胞缺氧時INa減小，復氧后INa進一步降低。另有研究[11~15]表明，缺氧可使INa減小，隨著缺氧時間延長，鈉通道的激活和失活時間也延長，再灌注后雖然INa激活時間恢復較快，但失活時間并不立即恢復?？焘c通道活性的降低使鈉離子快速內流受阻，心肌興奮性降低、興奮性恢復時間延長，細胞靜息電位下降可降低動作電位0相除極上升速度，導致沖動傳導減慢，繼而引起心肌細胞各種離子通道功能異常，易誘發折返性心律失常[16]。

紅景天苷是高原藏藥紅景天的主要活性成分。紅景天苷可明顯提高缺氧/復氧和氧化損傷的心肌細胞存活率，降低培養液中LDH、CK水平[17]；還能改善急性血瘀模型大鼠的血液流變學，增加缺血-再灌注后大鼠離體冠脈血流，增強心肌收縮力[2~5]。多項研究[6~8]表明，紅景天苷還有防治心律失常的作用，能通過不同途徑對心肌缺血-再灌注損傷進行干預。紅景天苷可抑制心肌缺血損傷后動作電位幅度下降和動作電位復極時間縮短。

本研究采用膜片鉗技術記錄大鼠心肌細胞INa，并給予紅景天苷灌流，結果發現，紅景天苷灌流后INa幅值增高，I-V曲線下移，但不改變I-V曲線的基本形狀，提示紅景天苷在不同膜電位水平對INa的作用是一致的。紅景天苷對INa激活的影響并不明顯，但能使INa失活曲線右移、增大失活電壓、減慢穩態失活過程。由此推測，紅景天苷對INa的增強作用或與減慢其失活過程有關。INa幅值增加可對抗心肌缺血損傷后動作電位幅度下降，改善缺血-再灌注后心肌細胞快鈉通道活性，調節Na+-Ca2+交換體功能，使鈣外排減少，產生強心作用，這些可能是紅景天苷抗心律失常、保護缺血-再灌注心肌的分子機制。

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(收稿日期：2015-10-21)

中圖分類號：R285. 5

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)07-0031-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.07.011

通信作者：李映新(E-mail: marchimoro@yeah.net)

基金項目：廣西壯族自治區大學生創新創業訓練計劃項目(201410598022)。