宮頸癌組織中APC、E-cadherin、ASC及FHIT基因啟動子區域甲基化觀察

王淑琴，黃利鳴，錢洪鑫，李紅月

(1三峽職業技術學院醫學院，湖北宜昌443002；2武漢大學；3湖北社會主義學院)

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·臨床研究·

宮頸癌組織中APC、E-cadherin、ASC及FHIT基因啟動子區域甲基化觀察

王淑琴1，黃利鳴2，3，錢洪鑫1，李紅月1

(1三峽職業技術學院醫學院，湖北宜昌443002；2武漢大學；3湖北社會主義學院)

摘要：目的觀察宮頸癌組織中結腸腺瘤性息肉病蛋白(APC)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、凋亡相關點狀蛋白(ASC)及脆性組氨酸三聯體(FHIT)基因啟動子甲基化狀態。方法 采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(MSP)檢測31例份宮頸癌組織和20例份正常宮頸上皮組織中的APC、E-cadherin、ASC、FHIT基因啟動子區域甲基化。分析APC、E-cadherin、ASC、FHIT基因啟動子甲基化與宮頸癌臨床病理參數的關系。結果31例份宮頸癌組織中測得基因啟動子區域甲基化27例份，其中APC、E-cadherin、ASC基因甲基化分別為19(61%)、17(55%)、6(19%)例份；單基因甲基化13例份，2個基因甲基化11例份，3個基因甲基化3例份。20例正常宮頸組織中均未測出基因啟動子區域甲基化。宮頸癌組織中APC、E-cadherin基因啟動子區域甲基化率高于正常宮頸組織(P均<0.05)。不同年齡、組織學分級及病理分期的宮頸癌患者腫瘤組織中APC、E-cadherin、ASC 基因啟動子區域甲基化狀態差異無統計學意義。結論 宮頸癌組織中APC、E-cadherin、ASC基因存在啟動子區域甲基化，可同時有多個基因甲基化。APC、E-cadherin、ASC基因啟動子區域甲基化可能參與了宮頸癌的發病。

關鍵詞：宮頸癌；啟動子區域甲基化；結腸腺瘤性息肉病蛋白；E-鈣黏蛋白；凋亡相關點狀蛋白；脆性組氨酸三聯體

近年來研究顯示，腫瘤發病與DNA甲基化模式異常有關，抑癌基因啟動子區域高甲基化是抑制基因轉錄的重要機制[1]。目前，國內外對宮頸癌基因甲基化的研究多數集中在單個基因，而后續研究提示宮頸癌可能同時存在多個基因的啟動子區域異常甲基化。本研究觀察了宮頸癌組織中結腸腺瘤性息肉病蛋白(APC)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、凋亡相關點狀蛋白(ASC)及脆性組氨酸三聯體(FHIT)基因啟動子區域甲基化狀態，探討基因啟動子區域甲基化在宮頸癌發生發展中的作用，分析基因啟動子區域甲基化狀態與宮頸癌臨床病理參數的關系。

1材料與方法

1.1實驗標本選取2013年12月~2014年5月手術切除或門診活檢取得的宮頸癌組織31例份，患者腫瘤臨床分期(FIGO)Ⅰ期16例、Ⅱ期13例、Ⅲ期2例，病理類型均為鱗狀上皮癌，組織學分級G14例、G215例、G312例。患者年齡23~70歲,術前均未進行放療及化療。取同期良性病變行子宮切除術取得的20例份正常宮頸鱗狀上皮作對照。所有標本取材后立即放入冰盒中，轉入-80 ℃冰箱保存。

1.2APC、E-cadherin、ASC、FHIT基因啟動子甲基化檢測

1.2.1組織DNA提取采用常規的蛋白酶K消化、酚/氯仿抽提和乙醇沉淀法，無菌雙蒸水溶解后用紫外分光光度計定量蛋白。A260/A280為1.6~1.8，樣品-20 ℃保存備用。

1.2.2DNA的亞硫酸氫鹽修飾DNA經過亞硫酸氫鹽修飾后，樣品DNA中所有未甲基化的胞嘧啶將被轉變為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶則不發生變化。取2 μg DNA，按甲基化分析試劑盒說明的操作步驟進行。

1.2.3甲基化特異性聚合酶鏈反應(MSP)第一輪PCR反應使用外側引物，反應總體系25 μL, 包括經過亞硫酸氫鹽修飾的DNA模版4 μL，10 mmol/L的dNTP 1 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，引物濃度10 pmol/L，Taq酶0.5 μL，反應條件為94 ℃預變性5 min，94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環35次，72 ℃延伸5 min。將第一輪PCR產物稀釋300倍，取4 μL進行第二輪PCR反應，此反應使用內側引物，反應總體系仍為25 μL，引物量為0.3 μL，其余不變，各基因的退火溫度與循環數見表1，其余反應條件與第一輪PCR反應相同。同時以人外周血淋巴細胞體外甲基化的DNA(IVD)作為陽性對照，以正常人外周血淋巴細胞DNA(NL)作為陰性對照，以水作空白對照。

1.2.4擴增產物鑒定取10 μL反應產物，經2%含有溴乙錠的瓊脂糖凝膠電泳，紫外成像系統下觀察并照相。

表1　APC、E-cadherin、ASC、FHIT基因引物序列及產物長度

1.3統計學方法采用SPSS14.0統計軟件。計數資料比較采用Fisher確切檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1宮頸癌組織中與正常宮頸組織中APC、E-cadherin、ASC、FHIT基因啟動子區域甲基化情況31例份宮頸癌組織中測得基因啟動子區域甲基化27例份，其中單基因甲基化13例份，2個基因甲基化11例份，3個基因甲基化3例份；APC、E-cadherin、ASC基因啟動子區域甲基化分別為19(61%)、17(55%)、6(19%)例份，而FHIT基因未檢測出甲基化。20例份正常宮頸組織中均未測出基因啟動子區域甲基化。宮頸癌組織中APC、E-cadherin基因啟動子區域甲基化率高于正常宮頸組織(P均<0.05)。

注：MW為DNA marker；IVD為甲基化陽性對照；NL為甲基化陰性對照；H2O為空白對照；S為調查樣本；T為宮頸癌組織；N為正常宮頸組織。

圖1宮頸癌組織與正常宮頸組織中APC、E-cadherin、

ASC、FHIT基因啟動子區域甲基化檢測結果

2.2APC、E-cadherin、ASC基因啟動子區域甲基化與宮頸癌臨床病理參數的關系不同年齡、組織學分級及病理分期的宮頸癌患者腫瘤組織中APC、E-cadherin、ASC 基因甲基化狀態差異無統計學意義。見表2。

表2　APC、E-cadherin、ASC基因啟動子區域甲基化

3討論

基因啟動子區域甲基化是在DNA甲基轉移酶催化下，利用S-腺苷甲硫氨酸提供的甲基，將甲基轉移到特定堿基的過程。甲基化反應不改變DNA序列和遺傳密碼，具有可逆性。人類許多基因中含有CpG序列密集區，稱為CpG島，常位于基因上游調控區的啟動子內，這些基因多為管家基因或組織特異表達基因。啟動子區的CpG島通常處于非甲基化狀態，基因可正常表達，當其發生甲基化時則影響基因轉錄調控，使基因表達沉默。一些腫瘤相關基因尤其是抑癌基因可因異常甲基化而失活，導致正常細胞生長分化調控失常。研究發現，在人類腫瘤與變異細胞中存在DNA異常甲基化，如APC、VHL、E-cadherin、P16基因啟動子區CpG島高甲基化[1~4]。

APC是Wnt信號轉導通路的重要組成部分，在細胞的生長發育、凋亡、遷移、信號傳遞等方面起著重要調控作用。APC基因失活使β-catenin蛋白降解障礙，導致游離β-catenin在胞質內積聚并易位入胞核，從而使Tcf/Lef激活，引起如c-myc、c-jun、Cyclin D1基因的異常轉錄，最終導致細胞發生惡變[5]。目前在結直腸癌、胃癌、胰腺癌及肝癌等惡性腫瘤中已發現APC基因啟動子區域高甲基化[6，7]，而關于宮頸癌的研究較少。E-cadherin是一種與癌細胞浸潤、轉移和分化密切相關的細胞黏附分子，E-cadherin表達下調將使細胞失去黏附，正常組織無法發育成形；對于惡性腫瘤，則細胞極性喪失、呈現惡性細胞形態并具備侵襲性生長特征[8,9]。ASC是一個新發現的抑癌基因，其編碼的蛋白具有促進細胞凋亡、激活Caspase和調節NF-κB活性等功能[10]。研究證實，在卵巢癌、非小細胞肺癌、乳腺癌等腫瘤中存在ASC基因啟動子區域的頻繁甲基化。有學者[11]發現乳癌細胞系甲基化誘導靜止基因(TMS1/ASC)表達缺失與TMS1/ASC基因CpG島高度甲基化相關。我們在宮頸癌組織中測出APC、E-cadherin、ASC基因啟動子區域甲基化，且APC、E-cadherin基因啟動子區域甲基化檢出率高于正常宮頸組織，與相關研究結果一致[8，9]。

FHIT基因是近年來在染色體3p區域發現的候選抑癌基因，可能通過誘導細胞凋亡、阻滯細胞周期發揮抑制腫瘤細胞增殖的作用。但我們未在宮頸癌組織中測得FHIT基因啟動子區域甲基化，這與相關研究[12]結果不一致，可能與標本取材、樣本數量有關，也可能與腫瘤組織中基因啟動子區域甲基化不均質性有關。

總之，宮頸癌組織中存在APC、E-cadherin、ASC基因啟動子區域甲基化，提示在宮頸癌發生、發展過程中存在多個基因的異常甲基化，APC、E-cadherin、ASC基因啟動子區域甲基化可能參與了宮頸癌的發病。

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(收稿日期：2015-11-06)

中圖分類號：R737.31

文獻標志碼：B

文章編號：1002-266X(2016)07-0039-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.07.014

通信作者：錢洪鑫(E-mail: 3812501@qq.com)