microRNA-10b及靶基因HOXD10在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)及侵襲能力的影響*

熊建寧，胡立春，王亞兵，段雪飛（廣東省佛山市南海區(qū)第三人民醫(yī)院肝膽外科，廣東佛山528244）

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microRNA-10b及靶基因HOXD10在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)及侵襲能力的影響*

熊建寧，胡立春，王亞兵，段雪飛
（廣東省佛山市南海區(qū)第三人民醫(yī)院肝膽外科，廣東佛山528244）

摘要：目的探討microRNA-10b（miR-10b）及其靶基因同源異性盒基因HOXD10在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)及轉(zhuǎn)染miR-10b對肝癌細(xì)胞侵襲性能力的影響。方法分析HOXD10基因在3種肝癌細(xì)胞株Huh7、HepG2、SMMC-7721中的基礎(chǔ)表達(dá)量，篩選出HOXD10基礎(chǔ)表達(dá)量高的HepG2作為后續(xù)研究對象。設(shè)計(jì)合成外源性miR-10b序列，用脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞株，設(shè)置miR-10b轉(zhuǎn)染組、無關(guān)序列轉(zhuǎn)染組（陰性對照組）和未處理組（對照組）。用RT-PCR及Western blot檢測肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-10b后HOXD10基因及蛋白表達(dá)量的變化，細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)研究轉(zhuǎn)染miR-10b對肝癌細(xì)胞侵襲能力。結(jié)果在基因水平和Western blot分析蛋白水平HOXD10基因表達(dá)量2-ΔΔCT分別是（1.24±0.23）、（1.00±0.02），P>0.05差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在蛋白分析HepG2細(xì)胞灰度計(jì)算值是值分別是653.492和1 968.742，蛋白水平表達(dá)降低。HOXD10基因在肝癌細(xì)胞株HepG2的表達(dá)量顯著高于Huh7和SMMC-7721；miR-10b成功轉(zhuǎn)染HepG2后，HOXD10基因表達(dá)水平與對照組比較無明顯變化，但HOXD10蛋白表達(dá)量與對照組比較下降及侵襲性也增強(qiáng)。結(jié)論miR-10b可能通過抑制靶基因HOXD10表達(dá)發(fā)揮作用，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲。

關(guān)鍵詞：肝癌細(xì)胞；microRNA-10b；HOXD10；侵襲

研究發(fā)現(xiàn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展與microRNA的關(guān)系越來越密切。microRNA-10b（miR-10b）在乳腺癌、胰腺癌、膠質(zhì)瘤等腫瘤組織中均有異常表達(dá)，并且與腫瘤的侵襲性和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[1]。HOXD10 （HomeoboxD10）被認(rèn)為可能是miR-10b的靶基因，屬于同源異型盒基因家族中的一員，位于2號染色體，是細(xì)胞分化、個(gè)體發(fā)育生長的關(guān)鍵基因位點(diǎn)。目前HOXD10基因與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系研究，主要集中在乳腺癌、血液病、食道癌、膠質(zhì)瘤等方面，與肝癌相關(guān)的研究較少[2]。本研究擬通過設(shè)計(jì)合成外源性miR-10b轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞株，轉(zhuǎn)染成功后，驗(yàn)證HOXD10基因及蛋白表達(dá)量的變化，探討轉(zhuǎn)染miR-10b對肝癌細(xì)胞侵襲能力的影響。

1　材料與方法

1.1材料和試劑

肝癌細(xì)胞株HepG2由廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心保存。RPMI 1640、DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清（Hyclone公司），Trizol試劑（美國Invitrogen公司），轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000（Invtrigen公司），一抗1∶1 000，二抗1∶5 000（美國Southern Biotech公司），體外侵襲實(shí)驗(yàn)裝置（美國BD公司），Transwell侵襲小室（美國Millipore公司）。

1.2生物信息學(xué)分析

TargetScan[http://www.targetscan.org/],picTar[http://pictar.org/],miRanda[http://www.microrna.org/microrna/]3種生物學(xué)軟件分析miR-10b可能調(diào)控的靶基因，選取HOXD10為目的基因。引物及miR-10b序列由廣州銳博生物科技有限公司合成。

1.3試驗(yàn)方法

肝癌細(xì)胞用DMEM、RPMI 1640完全培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)，收集對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，選擇HepG2細(xì)胞脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染miR-10b mimics24h用QPCR檢測。PCR分析mRNA表達(dá)量，通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）方法克隆非翻譯區(qū)（3'-UTR）引物序列為：HOXD10-正向引物：5'-CCGAAGTGCAGGAGAAGGAA；HOXD10-負(fù)向引物：5'-GTGTAAGGGCACCTCTTCTTTCTG，測序正確后常規(guī)方法轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，同時(shí)在細(xì)胞內(nèi)檢測HOXD10表達(dá)量。Western blot分析：用BCA法。體外細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-10b后HepG2接種至侵襲裝置，培養(yǎng)24 h后經(jīng)吉姆薩染色對穿膜細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，進(jìn)行正態(tài)性分析及獨(dú)立樣本t-test，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1HOXD10在3種肝癌細(xì)胞中表達(dá)及構(gòu)建高表達(dá)miR-10b

Huh-7細(xì)胞，HepG2細(xì)胞，SMMC-7721細(xì)胞HOXD10基因經(jīng)PCR比較基礎(chǔ)表達(dá)量2-ΔΔCT分別是1.00、228.71和1.55，見表1、圖1。蛋白分析HepG2細(xì)胞灰度計(jì)算值是930.22，Huh-7是406.00，SMMC-7721是249.00，見圖2。通過基因和蛋白實(shí)驗(yàn)結(jié)果篩選出表達(dá)量高的HepG2細(xì)胞符合下一步實(shí)驗(yàn)要求。miR-10b逆轉(zhuǎn)錄后表達(dá)量為（9 772.22± 437.99），與陰性對照組比較，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明構(gòu)建高表達(dá)miR-10b成功，見表2、圖3。

表1　HOXD10基因在3種肝癌細(xì)胞相對表達(dá)量（±s）

表1　HOXD10基因在3種肝癌細(xì)胞相對表達(dá)量（±s）

組別Huh7 HepG2 SMMC-7721基礎(chǔ)表達(dá)量2-ΔΔCT1.00±0.00 228.71±0.12 1.55±0.01

圖1　HOXD10在肝癌Huh7、HepG2以及SMMC-7721細(xì)胞表達(dá)量比較

圖2　HOXD10在肝癌Huh7、HepG2以及SMMC-7721細(xì)胞蛋白表達(dá)

2.2轉(zhuǎn)染后HOXD10在肝癌細(xì)胞中基因及蛋白表達(dá)

HepG2肝癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-10b的HOXD10實(shí)驗(yàn)組與陰性對照組，在基因水平和Western blot分析蛋白水平HOXD10基因表達(dá)量2-ΔΔCT分別是（1.24±0.23）和（1.00±0.02），P>0.05差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3、圖4。在蛋白分析HepG2細(xì)胞灰度計(jì)算值分別是1 968.742和653.492，蛋白水平表達(dá)降低，見圖5。

2.3體外細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

體外細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)穿膜細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示：HepG2轉(zhuǎn)染miR-10b過表達(dá)后（112.38±11.27），與陰性對照組（75.25±6.35）比較細(xì)胞侵襲能力增加（P<0.05）。見表4。

表2　轉(zhuǎn)染MiR-10b基因在3種樣品中相對表達(dá)量（±s）

表2　轉(zhuǎn)染MiR-10b基因在3種樣品中相對表達(dá)量（±s）

注：NC：過表達(dá)miR-10b的陰性對照組；miR-10b組：過表達(dá)miR-10b組；miR-10b組與NC組比較，t=-35.705，P=0.000

未處理組NC組組別miR-10b組基礎(chǔ)表達(dá)量2-ΔΔCT9 772.22±437.99 0 1.21±0.01

圖3　miR-10b在3種樣品中的表達(dá)水平

表3　轉(zhuǎn)染后肝癌細(xì)胞株HOXD10基因相對表達(dá)量（±s）

表3　轉(zhuǎn)染后肝癌細(xì)胞株HOXD10基因相對表達(dá)量（±s）

注：NC：過表達(dá)miR-10b的陰性對照組；miR-10b組：過表達(dá)miR-10b組；miR-10b組與NC組比較，t=6.245，P=0.220

組別miR-10b組基礎(chǔ)表達(dá)量2-ΔΔCT1.24±0.23未處理組NC組1.47±0.22 1.00±0.12

圖4　miR-10b在轉(zhuǎn)染后HOXD10表達(dá)

圖5　Western blot分析轉(zhuǎn)染后蛋白表達(dá)

表4　細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)穿膜細(xì)胞計(jì)數(shù)（±s）

表4　細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)穿膜細(xì)胞計(jì)數(shù)（±s）

注：未處理組：HepG2；NC：過表達(dá)miR-10b的陰性對照組；miR-10b組：過表達(dá)miR-10b組；F=6.726，P=0.006組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，miR-10b組與NC組比較，P=0.043

NC組miR-10b組75.25±6.35 112.38±11.27組別未處理組細(xì)胞計(jì)數(shù)79.38±4.16

3　討論

miRNA在轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)和生物行為發(fā)展過程起著重要調(diào)控作用，大多數(shù)人類癌癥與miRNA發(fā)揮抑癌基因或癌基因作用有關(guān)[3]。腫瘤發(fā)生在染色體易變位點(diǎn)上，即染色體上易發(fā)生丟失、移位或重復(fù)的部位，是微小RNA表達(dá)異常與某些腫瘤關(guān)系密切的原因[4]。肝細(xì)胞癌中2號染色體短臂發(fā)生突變，而miR-10b恰位于該突變部位。Ma等[5]發(fā)現(xiàn)miR-10b高表達(dá)和腫瘤細(xì)胞的血管侵襲相關(guān)；特異性增加miR-10b表達(dá)量可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲。Laderio等[6]報(bào)道109例肝臟樣本肝細(xì)胞癌29例、肝良性病變局灶性結(jié)節(jié)性增生5例，癌旁組織93例，其中miR-10b表達(dá)量顯著高于良性病變和未發(fā)生腫瘤病變的肝臟組織，同時(shí)把miR-10b看做肝臟腫瘤細(xì)胞侵襲性、轉(zhuǎn)移的相關(guān)因素；說明在肝癌組織中miR-10b表達(dá)上調(diào)，可抑制某些靶基因表達(dá)而發(fā)揮癌基因作用。HOXD10基因同樣位于2號染色體，是細(xì)胞分化、個(gè)體發(fā)育生長的關(guān)鍵基因位點(diǎn)[7]。受到miR-10b及其他多種負(fù)性調(diào)控作用，HOXD10在多數(shù)惡性腫瘤表達(dá)缺失，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力[8]。Myers等[9]研究表明持續(xù)表達(dá)的HOXD10基因，對乳腺腫瘤細(xì)胞新生血管的生成起到一定的抑制作用。Carrio等[10]在HOXD10抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移研究中同樣發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)HOXD10可以抑制新生毛細(xì)血管形成，從而抑制正常腦細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞分化，因此，HOXD10被認(rèn)為是抑癌基因。上調(diào)miR-10b可以抑制mRNA編碼HOXD10翻譯過程，導(dǎo)致增加有潛在轉(zhuǎn)移性質(zhì)的基因RHoC，并且發(fā)現(xiàn)隨著進(jìn)展期乳腺癌腫瘤侵襲程度增加，HOXD10表達(dá)卻逐漸消失[11]。HOXD10過表達(dá)可以抑制RHoC蛋白的表達(dá)，進(jìn)而可以阻止miR-10b誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移[12]。Liao等[13]試驗(yàn)60例不同肝細(xì)胞肝癌TNM分期中miR-10b表達(dá)情況與肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力相關(guān)，得出miR-10b負(fù)調(diào)控HOXD10在轉(zhuǎn)錄后水平通過HOXD10相關(guān)基因RhoC/uPAR/MMPs促進(jìn)肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲。

總結(jié)分析得出實(shí)驗(yàn)采用微小RNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法，可以提高miR-10b基因在轉(zhuǎn)染細(xì)胞HepG2細(xì)胞中的表達(dá)量，在靶基因基礎(chǔ)表達(dá)量高的前提下，通過RT-PCR和Western blot方法研究在肝癌細(xì)胞中HOXD10基因和蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HOXD10在mRNA水平變化小而蛋白水平表達(dá)是降低的，說明miR-10b是通過轉(zhuǎn)錄后翻譯階段來調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，該靶基因可能起到抑制癌基因作用，過表達(dá)miR-10b增加了HepG2細(xì)胞侵襲能力。miR-10b過表達(dá)與肝細(xì)胞癌的侵襲關(guān)系密切，為進(jìn)一步研究肝癌細(xì)胞的多種生物學(xué)特征提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（張蕾編輯）

Expression of miR-10b and target gene HOXD10 in liver cancer cell lines and its impact on tumor invasion*

Jian-ning Xiong,Li-chun Hu,Ya-bing Wang,Xue-fei Duan
(Department of Hepatobiliary Surgery,the Third People's Hospital of Nanhai,Foshan,Guangdong 528244,China)

Abstract:Objective To investigate the expression of miR-10b and its targeted gene HOXD10 in hepatic carcinoma cell lines and its influence on tumor invasion.Methods Basic expression of HOXD10 gene in the three hepatic carcinoma cell lines (Huh7,HepG2 and SMMC-7721) was determined.Mature mimics of miR-10b were chemically synthesized and transiently transfected into higher HOXD10-expression cell line HepG2 cells via lipofectamine 2000.Cells were also transfected with empty vectors and unrelated fragment to serve as negative controls.The invasion of HepG2 cells was investigated by Transwell assay.The expressions of HOXD10 were detected by RT-PCR and Western blot.Results The expression levels of gene and protein at 2-Δ Δ CTwere (1.24±0.23) and (1.00±0.02) without significant difference (P > 0.05).In protein analysis of HepG2 cells,gray value was calculated to be 653.492 and 1968.742 respectively,and protein expression levels were reduced.Target gene HOXD10 was over-expressed in HepG2 cells and the ability of tumor invasion increased.Conclusions Synthesized miRNA-10b can regulate the expression of target gene HOXD10 and promote the invasion of the hepatic carcinoma cells.

Keywords:hepatic carcinoma cell; miRNA-10b; HOXD10; invasion

[通信作者]胡立春，E-Mmail：spring@126.com，Tel：13702984975

*基金項(xiàng)目：廣東省佛山市衛(wèi)生和計(jì)劃局醫(yī)學(xué)科研課題（No：2015343）

收稿日期：2015-10-25

文章編號：1005-8982（2016）06-0011-04

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.06.003

中圖分類號：R735.7

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A