VEGF-C在胃癌中的表達與微血管密度和淋巴結轉移的關系及臨床意義

周鳳鳴　彭慶弟

635000 四川省達州市中心醫院

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VEGF-C在胃癌中的表達與微血管密度和淋巴結轉移的關系及臨床意義

周鳳鳴彭慶弟

635000 四川省達州市中心醫院

【摘要】目的探討VEGF-C在胃癌中的表達與微血管密度和淋巴結轉移及胃癌發生發展及預后的關系。方法納入行胃癌手術切除患者的病例樣本共計96例，對這96例胃癌樣本采用qPCR檢測血管內皮生長因子-C(VEGF-C)的相對表達量及檢測微血管密度(MVD)參數，并與淋巴結轉移等預后情況進行相關性分析。結果VEGF-C相對表達量與患者的一般資料如年齡、性別、以及腫瘤的特征如大小、發病的部位、侵襲深度，腫瘤的分期及分化程度、是否遠處轉移等并不存在相關性(P>0.05)。而淋巴受累方面，淋巴受累組的VEGF-C相對表達量明顯上調(P<0.05)，而無淋巴受累組的相對表達量與正常組相比差異無統計學意義(P>0.05)，VEGF-C相對表達量明顯上調與淋巴結受累轉移的風險有關。VEGF-C表達水平與MVD差異表達具有相關性。結論VEGF-C相對表達量水平與胃癌的淋巴結轉移及預后有一定的相關性，但還需進一步系統研究。

【關鍵詞】胃癌；預后；VEGF-C；微血管密度；淋巴結轉移；相關性

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:533～536)

胃癌是消化道最常見的惡性腫瘤之一，我國的胃癌發病率一直居高不下，在世界范圍內我國胃癌發病率約占47%，且多數患者患病后初次就診已經伴有廣泛的淋巴結轉移或者遠端的轉移，失去了根治手術的機會，耽誤了治療的最佳時機。早期診斷對疾病的及時發現及治療具有重要的臨床意義[1-2]。近年來研究發現，在乳腺癌、肝癌、膽管癌、胃癌等多種腫瘤中VEGF-C在調控腫瘤血管的生成中具有重要的作用，在胃癌的發病中存在VEGF-C的上調，其作為促癌基因發揮腫瘤生長調控作用[3]。本研究收集胃癌患者VEGF-C的表達情況、淋巴結轉移及MVD參數資料，通過分析VEGF與微血管新生及模式的演變規律，進一步探討胃癌的抗血管生成及淋巴結轉移之間的關系。

1材料與方法

1.1病例的收集

納入我院普外科2012年1月至2015年1月行胃癌手術切除的96例患者病例樣本，通過病理診斷均確診為原發性胃癌，納入研究的所有患者均為初診的患者，且在術前未進行任何放療、化療及分子靶向治療等。96例中男性74例，女性22例，年齡42～78歲，平均年齡為(61.34±1.13)歲。在術中取材之后，腫瘤的位置以病理組織報告為標準，將樣本立即放置入液氮罐中保存，轉入-80 ℃冰箱長期保存，在實驗前取出，提取胃癌組織的RNA，同時進行病理學的監測，對胃癌組織的病理學進行分型，腫瘤的浸潤程度按照國際抗癌聯盟標準分類[4]，淋巴分化以及轉移采用的國際WHO的診斷標準[5]進行分析判斷，對所有手術治療的患者從出院到死亡進行隨訪觀察，隨訪的時間以每月1次。同時納入健康人群23例作為對照組，所有受試者簽訂知情同意書，收集標本前該臨床試驗研究通過了醫院倫理委員會的批準。

1.2實驗試劑和儀器

試劑：Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG(美國Invitroge公司)，TaqMix(東盛生物公司)，PCR試劑盒、TaqMan RNA試劑盒(美國Santa Cruz公司)，RNA提取試劑盒采用(美國Sigma)，DEPC(上海碧云天生物)，乙醇、異丙醇、氯仿(上海碩盟生物)。

儀器：高速冷凍離心機(德國BiofugeStratos)，-80 ℃~4 ℃冰箱(日本松下)，PCR儀(澳大利亞Rotor-gene)，紫外分光光度儀(Beckman Coulter 公司)。

1.3RNA提取及qPCR檢測

對96例胃癌組織采用RNA提取試劑盒進行RNA提取，采用TaqMan RNA試劑盒檢測VEGF-C的相對表達量。采用RNU6作為內參進行校正。對VEGF-C的表達水平采用二步法進行檢測，第一步是通過莖環引物來合成互補DNA，再通過RNA的逆轉錄系統對10 ng RNA進行逆轉了反應體系進行反應，在PCR管加入10 μl的逆轉錄緩沖液，總的RNA濃度調整到2 ng/μl，最后加入5 μl的逆轉錄引物，在冰上混勻之后反應5 min，行梯度變形反應，反應條件為94 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、60 s，72 ℃、7 min，一次遞減；第二步采用Platinum SYBR Green qPCR的反應體系，該體體系具體形式：Taqman RNA的特異性引物與2×的 PCR Taqman Universal混合液相互混合之后通過逆轉錄PCR反應，再加入5μlcDNA到RNA的去酶的水當中，將體積擴增至20 μl，通過循環反應94 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、60 s，72 ℃、7 min遞減的擴張40個循環之后，對實驗結果進行分析，采用熒光實時定量反應，按照PCR操作說明，Ct的檢測值應當在20～32之外的需要進行第2次檢測。應用△Ct=CtVEGF-C-CtRNU6的計算公式計算VEGF-C的相對表達量。

MVD的檢測：資深病理專家對切片復核確認，利用相應的存檔組織蠟塊進行VEGF-C免疫組化染色，標記微血管密度，記錄觀察微血管的生長模式。

1.4統計學檢測

所有納入分析研究的數據采用SPSS 21.0的統計軟件建立數據庫，將VEGF-C表達水平分為2組，小于平均值為低表達組，大于平均值作為高表達組。通過分析VEGF-C的表達水平高低與發病相關因素分析以逐步回歸法篩選有統計學意義的變量，對臨床病理因素之間的風險情況采用Logistic回歸分析，組間比較用方差分析，組間均數比較采用t檢驗，組間率的比較用卡方檢驗，兩兩比較采用LSD檢驗。應用Kruskal-wallis H檢驗進行多組間數據的比較，具有統計學差異的以P<0.05表示。

2結果

2.1VEGF-C的相對表達量與臨床病理特征之間的相關性

96例胃癌組織的VEGF-C的相對表達量為1.436，95%CI為0.323～0.534，表達量低于平均值的有42例，高于平均值的有54例。VEGF-C相對表達量與患者的一般資料如年齡、性別、以及腫瘤的特征如大小、發病的部位、侵襲深度，腫瘤的分期及分化程度、是否遠處轉移等并不存在相關性(P>0.05)。而淋巴受累方面，淋巴受累組的VEGF-C相對表達量明顯上調(P<0.05)，而無淋巴受累組的相對表達量與正常組相比差異無統計學意義(P>0.05)，VEGF-C相對表達量明顯上調與淋巴結受累轉移的風險有關，見表1。

2.2VEGF-C相對表達量的高低與淋巴結轉移風險之間的關系

采用logistic回歸分析VEGF-C相對表達量的高低與淋巴結轉移風險之間的相關性，VEGF-C相對表達量的上升會增加胃癌淋巴結轉移的風險性，OR(95%CI)=3.15(2.13～9.27)，通過調整風險其OR=5.16，95%CI為1.27～20.83，P=0.03。

2.3胃癌組織中VEGF-C的表達水平與MVD的相關性

VEGF的蛋白表達水平與MVD差異表達具有相關性(高表達：γ=0.86，P=0.01，低表達：γ=0.75，P=0.02)，見表2。

表1　VEGF-C的相對表達量與臨床病理特征之間的相關性

表2　胃癌組織中VEGF-C的表達與MVD的關系

3討論

臨床實踐研究發現，多數早期胃癌在發病的初期并無明顯的臨床癥狀，在首次就診時大部分胃癌患者已經進入中晚期，因此胃癌患者預后極差，生存率較低[4]。通過大量的臨床研究發現，血管內皮生長因子-C是腫瘤調控中發揮生物學效應的重要分子，參與著各類腫瘤細胞的增殖凋亡、生長、發育以及侵襲轉移，涉及到各類腫瘤的發生發展，同時也是目前研究腫瘤分子機制的熱點內容[5-6]。腫瘤微血管新生是其浸潤和遠處轉移的前提條件[7-8]，目前評價腫瘤血管生成的標準是測定腫瘤微血管密度(MVD)。而腫瘤微血管存在多種不同的模式，勢必對腫瘤的進展及預后產生影響，但是有關微血管模式與腫瘤進展以及脈管內癌栓、局部腫瘤浸潤等高危因素的以及預后的關系鮮見報道[9-10]。研究提示了VEGF-C可以用于對腫瘤預后的評估，其表達量與腫瘤的預后有著一定的相關性[11-12]。

近年來胃癌的發病率呈逐年上升的趨勢，雖然治療水平不斷提高，但是患者的生存率并未得到明顯提高，其轉移與復發仍是其死亡的主要原因。國內外目前對胃癌的診斷研究主要集中在病因學、遺傳基因、早期診斷手段的研究，治療方面研究主要集中在放射、化學以及手術方法改進等方面，雖然取得了一定進展，但該病的發病率及死亡率并未得到明顯降低，說明研究的深度尚不足，研究還處于基礎階段尚未應用于臨床[11]。由于胃癌作為惡性腫瘤，對人類生命具有重大的威脅。因此，進一步尋找有關胃癌復發、轉移生物標記物及敏感特異是該病有效治療、提高生存率的關鍵點。其次做好胃癌發病的預防及早期發現，減少其發病率和轉移率，是今后研究的重要方向[13]。VEGF-C具有增強微血管通透性，其特異性作用于血管內皮細胞，為腫瘤的浸潤轉移提供條件，刺激內皮細胞促進腫瘤血管生成。研究表明腫瘤細胞中VEGF-C的水平上調，具有促進腫瘤的生長的作用[14]。本研究通過分析VEGF-C在胃癌中的表達與微血管密度和淋巴結轉移及胃癌發生發展及預后的關系，為胃癌的抗血管生成治療研究提供理論依據。結果顯示，VEGF-C相對表達量與患者的一般資料如年齡、性別、以及腫瘤的特征如大小、發病的部位、侵襲深度，腫瘤的分期及分化程度、是否遠處轉移等并不存在相關性；而淋巴受累方面，淋巴受累組的VEGF-C相對表達量明顯上調，VEGF-C相對表達量明顯上調與淋巴結受累轉移的風險有關，同時發現VEGF-C表達水平與MVD差異表達具有相關性，對早期胃癌的診斷具有一定的作用。

綜上所述，我們發現VEGF-C在胃癌表達上調，與淋巴結轉移有著密切的相關性，提示VEGF-C可能與胃癌的轉移侵襲等影響預后的因素有關，該分子差異性表達推測可能是胃癌早期的潛在靶點，但是本研究不足的是病例數還相對較少，VEGF-C在胃癌中的作用機制和靶基因生物學預測和闡明有待于進一步研究。

參考文獻

[1]Zhang J，Guo SB，Duan ZJ.Application of magnifying narrow-band imaging endoscopy for diagnosis of early gastric cancer and precancerous lesion〔J〕.BMC Gastroenterol，2011，11：135.

[2]GASTRIC (Global Advanced/Adjuvant Stomach Tumor Research International Collaboration) Group，Paoletti X，Oba K，et al.Benefit of adjuvant chemotherapy for resectable gastric cancer：a meta-analysis〔J〕.JAMA，2010，303(17)：1729-1737.

[3]Washington K.7th edition of the AJCC cancer staging manual：stomach〔J〕.Ann Surg Oncol，2010，17(12)：3077-3079.

[4]Li ML，Zhang JC，Li SG，et al.Characteristic gene expression profiles in the progression from normal gastric epithelial cells to moderate gastric epithelial dysplasia and to gastric cancer〔J〕.Chin Med J(Engl)，2012，125(10)：1777-1783.

[5]Mees ST，Mardin WA，Wendel C，et al.EP300--a miRNA-regulated metastasis suppressor gene in ductal adenocarcinomas of the pancreas〔J〕.Int J Cancer，2010，126(1)：114-124.

[6]Kaemmerer D，Peter L，Lupp A，et al.Comparing of IRS and Her2 as immunohistochemical scoring schemes in gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors〔J〕.Int J Clin Exp Pathol，2012，5(3)：187-194.

[7]Ouyang G，Wang Z，Fang X，et al.Molecular signaling of the epithelial to mesenchymal transition in generating and maintaining cancer stem cells〔J〕.Cell Mol Life Sci，2010，67(15)：2605-2618.

[8]Jiang Z，Guo J，Xiao B，et al.Increased expression of miR-421 in human gastric carcinoma and its clinical association〔J〕.J Gastroenterol，2010，45(1)：17-23.

[9]Sun T，Wang C，Xing J，et al.MiR-429 Modulates the expression of c-myc in human gastric carcinoma cells〔J〕.Eur J Cancer，2011，47(17)：2552-2559.

[10]Chen L，Tang Y，Wang J，et al.miR-421 induces cell proliferation and apoptosis resistance in human nasopharyngeal carcinoma via downregulation of FOXO4〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2013，435(4)：745-750.

[11]Ohashi S，Natsuizaka M，Naganuma S，et al.A NOTCH3-m-

ediated squamous cell differentiation program limits expansion of EMT-competent cells that express the ZEB transcription factors〔J〕.Cancer Res，2011，71(21)：6836-6847.

[12]Dominissini D，Moshitch-Moshkovitz S，Amariglio N，et al.

Adenosine-to-inosine RNA editing meets cancer〔J〕.Carcinogenesis，2011，32(11)：1569-1577.

[13]Moretta L，Locatelli F，Pende D，et al.Killer Ig-like receptor-mediated control of natural killer cell alloreactivity in haploidentical hematopoietic stem cell transplantation〔J〕.Blood，2011，117 (3)：764-771.

[14]Yanaba K，Yoshizaki A，Asano Y，et al.IL-10-producing r-

egulatory B10 cells inhibit intestinal injury in a mouse model〔J〕.Am J Pathol，2011，178(2)：735-743.

(編輯：甘艷)

Relationship between VEGF-C Expression and Microvascular Density and Lymph Node Metastasis in Gastric Cancer and Its Clinical Significance

ZHOUFengming，PENGQingdi.SichuanDazhouCentralHospital，Dazhou，635000

【Abstract】ObjectiveTo study the relationship between VEGF-C expression and microvascular density，lymph node metastasis and development and prognosis of gastric cancer.Methods96 cases of patients treated with gastric cancer resection were collected， qPCR was used to detect relative expression of vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C) and microvessel density (MVD) parameters，and lymph node metastasis received correlation analysis.ResultsVEGF-C relative expression had no correlation with patient's general information such as age，sex，and tumor characteristics such as size，site of disease，depth of invasion，tumor stage and degree of differentiation，metastasis(P>0.05)；in lymphatic involvement，relative expression of VEGF-C of lymphatic involvement group significantly increased(P<0.05)，relative expression of VEGF-C of without lymph node involvement and the normal group had no statistically significant difference(P>0.05)，increase of VEGF-C expression was related to risk of lymph node involvement and metastasis；VEGF-C expression and differential expression of MVD were correlated.ConclusionVEGF-C relative expression level and lymph node metastasis and prognosis of gastric cancer have some relevance，but need to be further studied.

【Key words】Gastric cancer；Prognosis；VEGF-C；Microvessel density；Lymph node metastasis；Correlation

(收稿日期2015-11-19修回日期 2016-02-14)

中圖分類號：R735.2

文獻標識碼：A

文章編號：1001-5930(2016)04-0533-04

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.04.004