FBN1新生突變引起的馬凡綜合征及其基因型-表型的關聯研究*

潘啟豪，　梁小碧，　郭　勇，　朱浚文，　胡　彬，　王一鳴

(中山大學 1中山醫學院醫學遺傳學教研室， 2疾病基因組研究所，廣東 廣州 510080； 3廣州市婦女兒童醫療中心，心臟中心，廣東 廣州 510120； 4廣州市公安局白云區分局刑警大隊技術中隊，廣東 廣州 510420； 5廣州市公安局黃埔區分局，廣東 廣州 510700； 6中山大學新華學院，廣東 廣州 510520; 7華大基因，廣東 深圳 518083)

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FBN1新生突變引起的馬凡綜合征及其基因型-表型的關聯研究*

潘啟豪1, 2，梁小碧3，郭勇4，朱浚文5，胡彬1, 2，王一鳴6, 7△

(中山大學1中山醫學院醫學遺傳學教研室，2疾病基因組研究所，廣東 廣州 510080；3廣州市婦女兒童醫療中心，心臟中心，廣東 廣州 510120；4廣州市公安局白云區分局刑警大隊技術中隊，廣東 廣州 510420；5廣州市公安局黃埔區分局，廣東 廣州 510700；6中山大學新華學院，廣東 廣州 510520;7華大基因，廣東 深圳 518083)

[摘要]目的： 本研究對2個不同馬凡綜合征(Marfan syndrome)的小家系進行致病基因FBN1的編碼區和剪切位點突變檢測，以尋找致病的突變，并初步探索馬凡綜合征基因型-表型的關聯。方法: 通過臨床檢查、實驗室檢查及心臟超聲檢查確診2個無血緣關系的家庭中原疑似為馬凡綜合征的3例患者。運用新一代測序對家系1的疑似患者行FBN1基因的全外顯子組測序，并對檢出的致病性遺傳變異進行Sanger驗證及在所有家系成員中驗證；對于家系2的存活成員，本研究直接進行PCR擴增FBN1基因的所有編碼區及剪切位點，對產物進行直接Sanger測序。另外在50個正常對照中對新發現的突變位點進行基于PCR產物的測序分析，以排除多態性；并對實驗結果行生物信息學分析。結果: 所有存活的疑似患者均確診為馬凡綜合征。在家系1中，我們檢測到了一個FBN1基因數據庫中尚未報道的新突變c.4685G>A(p.Cys1562Tyr)，并且患者父母和同胞姐姐均未檢測到此變異，故此突變為一個新生突變。該錯義突變使第1 562位上極性中性的含硫的半胱氨酸被極性中性的含羥苯基的酪氨酸所替代，影響了fibrillin-1蛋白一個TGF-β結合結構域，導致蛋白質的二級結構發生改變。家系2含父母及一對同卵雙胎患者，其中一患者已去世。我們在存活患者檢測到1個FBN1基因的已報道致病突變c.3706T>C (p.Cys1236Arg)，該突變在患者父母中不存在，故也為新生突變。結論: 本文報道了一例FBN1基因的新突變及另一例由FBN1基因已知突變引起的馬凡綜合征，二者皆為新生突變，并在家系中進行了基因型-表型的比較，表明家系1的新突變可能與經典馬凡綜合征的表型相關，而家系2的已知突變確和新生兒重癥馬凡綜合征表型相關。

[關鍵詞]馬凡綜合征； FBN1基因； 新生突變； 基因型; 表型

馬凡綜合征(Marfan syndrome)是一種常染色體顯性遺傳的全身性結締組織病，其發病率約為1/5 000[1]，臨床表現主要有蜘蛛指/趾、脊柱側彎，主動脈病變，晶狀體異位及硬腦膜膨出等。在遺傳學上，絕大部分的馬凡綜合征致病基因定位于15q21.1的FBN1，該基因包含有65個編碼外顯子，編碼原纖維蛋白1(fibrillin-1)。Fibrillin-1有47個上皮生長因子樣結構域和9個轉化生長因子β結合結構域(transforming growth factor-β binding domain, TB domain)，是細胞外基質結構組成部分，主要參與細胞生長與維持。它主要表達部位在血管、軟骨、腎臟、肺部、皮膚、尿道以及人的骨骼中和骨細胞，是眼球晶狀體懸韌帶的主要成分。FBN1基因的錯義突變和顯性負效應是導致細胞外基質fibrillin-1缺陷的主要遺傳因素。

本研究收集了2個馬凡綜合征的家系進行研究。對于家系1，我們對先證者先行二代測序再行Sanger驗證；家系2含2例患者為同卵雙胎，其中1例已病故，我們對存活患者進行FBN1基因所有編碼區及剪切位點的突變檢測。檢測結果均在家系中其他成員進行驗證，現將結果報道如下。

材料和方法

1研究對象

本研究納入的2個無血緣關系的小家系(圖1)均來自廣州市婦女兒童醫療中心，同時納入了50例無血緣關系的正常人作為對照組。所有家系成員均經過詳細的病史采集及體格檢查，所有患者均行心臟彩超檢查。馬凡綜合征的診斷符合Ghent診斷標準。家系1 中的先證者和家系2 中的先證者及其同卵雙生的弟弟被診斷為患者，其余家庭成員均為無發現馬凡綜合征的正常人。本研究符合“2013年修訂的赫爾辛基宣言原則”并取得了中山大學中山醫學院倫理委員會的批準，所有的研究對象均簽署了知情同意書(小于18周歲的研究對象由其監護人簽署知情同意書)。

家系1患兒13歲，因“發現心臟異常1周”就診，活動耐量與正常小孩無異，當地醫院查有“晶狀體脫位”，其余體查無明顯異常，行心臟彩超提示“主動脈竇部明顯擴張(最寬處內徑36 mm)并局限返流”。

家系2患兒為7月大的足月兒，因“氣促10 d，咳嗽2 d”住院治療，體查可見其身長較長，胸廓呈雞胸，胸骨隆起，雙肺呼吸音增粗，偶可及干濕啰音。心律齊，心音稍鈍，心率142 min-1，心尖區可及收縮期2/6級柔和雜音，無傳導。雙上肢肘關節內翻，活動度正常，手指、腳趾細長。行胸片提示“脊柱側彎”，行心臟彩超提示 “主動脈竇部擴張(最寬處內徑22 mm)”，見圖2。其一雙胞胎哥哥于3月大時被診斷為“馬凡綜合征、呼吸衰竭”，4月大時死于多器官功能衰竭。隨訪該患兒，其出院后因反復感染入住不同醫院，并于1歲5月死于多器官功能衰竭。

2方法

2.1基因組DNA的提取取所有成員外周血200 μL，根據Tiangen血液基因組小量抽提試劑盒方法抽提DNA。

2.2引物設計及PCR擴增利用UCSC數據庫(http：//genome.ucsc.edu)獲取FBN1基因的序列信息。利用Oligo 6.0軟件設計 65對引物，覆蓋所有編碼區域及剪切位點。所有引物均由深圳華大基因研究院(BGI tech)合成，需要引物序列的讀者可向作者索取。PCR擴增反應體系為普通30 μL體系：10×Taq buffer 3 μL,25 mmol/L MgCl22.5 μL,2.5 mmol/L dNTP mixture 3 μL,3.2 μmol/L上、下游引物各1 μL,Taq DNA polymerase 1 μL(Thermo),DNA模板12.3Sanger測序及突變分析鑒定應用ABI 3730XL DNA測序儀對所有PCR產物行直接測序；應用軟件Sequence Scanner 1.0(Applied Biosystems)對測序結果進行分析判讀[2]。突變命名參考標準的序列變異命名法則(http://www.hgvs.org/mutnomen)；將檢測到的遺傳突變與人類基因組突變數據庫(http://www.hgmd.cf.ac.uk)進行比對并查PubMed上已發表的文章確定所檢突變是否為已知突變。對于錯義突變的位點，利用Clustal Omega program(http://www.uniprot.org/align/)進行物種保守性比對，并利用SIFT軟件進行功能學預測。

Figure 1.Pedigree of 2 families with Marfan syndrome was shown. A filled square indicated an affected male. The proband is marked by an arrow.

圖12個馬凡綜合征家系的家系圖

Figure 2.Echocardiogram of the patient (II:2) in the family 2.

圖2家系2患者(II:2)的心臟超聲影像

結果

1家系1突變檢測結果

本家系患者二代測序[3]及直接測序結果發現一個位于第37外顯子且預測為“DAMAGING”的錯義突變c.4685G>A(p.Cys1562Tyr)，見圖3，該突變未見報道且在家系其余成員中均未檢出該突變，為新的denovo突變。它使得第1 562位上極性中性的含硫的半胱氨酸被極性中性的含羥苯基的酪氨酸所替代，影響了fibrillin-1蛋白的1個TB domain，導致蛋白質的二級結構發生改變。

Figure 3.Partial sequencing results of patient II:2 (A), his parents (B, C) and his sister (D) in family 1. The arrows indicate the position of the mutation c.4685G>A (p.Cys1562Tyr).

圖3家系1各成員的c.4685G>A (p.Cys1562Tyr)突變檢測結果

2家系2突變檢測結果

本家系存活患者的直接測序結果發現了一個位于第29外顯子且預測為“DAMAGING”的錯義突變c.3706T>C (p.Cys1236Arg)，見圖4，是已報道的致病突變并被收錄在HGMD數據庫中。該突變在表型正常的父母中均未檢出該突變，為denovo突變。它使得第1 236位上極性中性的含硫的半胱氨酸被堿性氨基酸的精氨酸所替代，影響了fibrillin-1蛋白的其中一個EGF-like calcium-binding 19 domain，導致了蛋白質功能的缺陷。

3突變氨基酸在物種間的保守性比對結果

2個家系中發現的2個錯義突變c.4685G>A(p.Cys1562Tyr)和c.3706T>C(p.Cys1236Arg)在氨基酸水平進行人類、猩猩、牛、大鼠以及小鼠這6種生物的物種保守性比對的結果顯示，被替代的氨基酸均發生在高度保守的氨基酸區域，見圖5。

討論

本研究對2個馬凡綜合征的小家系進行了FBN1基因的突變檢測，發現患者均攜帶FBN1基因的致病性突變。家系1的先證者中發現的錯義突變c.4685G>A(p.Cys1562Tyr)為一個國際上未報道的新的新生突變。Biggin等[4]在對57個無關個體的馬凡綜合征患者進行FBN1基因的測序結果中發現，一個表現為下肢長度比例增加、關節活動度增大、上腭狹窄特征的面部表型以及主動脈擴張的患者攜帶的錯義突變c.4691G>A(p.Cys1564Tyr)在我們家系1中發現的新突變附近，且影響了TB結構域，因此佐證了我們對家系1新突變致病性的推斷。而在家系2的患者中發現的錯義突變c.3706T>C(p.C1236R)為一個已報道的新生突變，該突變被認為與新生兒馬凡綜合征發病相關。

Figure 4.Partial sequencing results of patient II:2 (A) and his parent (B, C) in family 2. The arrows indicate the position of the mutation c.3706T>C (p.Cys1236Arg).

圖4家系2各存活成員的c.3706T>C (p.Cys1236Arg) 突變檢測結果

結合兩患兒的發病年齡、病情進展及預后，家系1的患兒發病較晚、病情進展緩慢、預后較好，符合經典的馬凡綜合征；家系2的患兒及其同胞哥哥發病早、病情進展迅速、死亡率高，符合新生兒馬凡綜合征的診斷。經典的馬凡綜合征患者通常青春期或者成年后起病，如治療及時，預后相對較好；新生兒馬凡綜合征是馬凡綜合征中極其罕見的一種分型，這類患兒病情進展迅速，累及全身多器官，約一半的患兒在一歲左右死于心臟衰竭或其它系統衰竭[5]。Kirschner等[6]研究指出，經典馬凡綜合征與新生兒型馬凡綜合征表現出fibrillin-1蛋白酶易脆性以及蛋白功能的差異。與經典馬凡綜合征或野生型fibrillin-1相比，具有新生兒馬凡綜合征突變的fibrillin-1更易于被溶蛋白酶裂解且影響了與肝素/硫酸乙酰肝素的相互作用，阻礙了微纖維的正確裝配。Stheneur等[7]的研究發現，發生在FBN1第24～32外顯子的突變通常與新生兒馬凡綜合征相關。他們還認為位于半胱氨酸區域的突變攜帶者發生晶狀體脫位的比例顯著高于不位于半胱氨酸區域攜帶者[8]。在本研究的兩個家系中，家系1患兒查體有“晶體脫位”，家系2患兒因其突出的呼吸循環障礙的表型，并未查眼部情況。

馬凡綜合征的臨床表型具有多變性[9]，且其基因型-表型的關系并未被充分的研究。由于FBN1突變引起的馬凡綜合征會導致全身性結締組織病，影響患者的日常活動甚至生活質量；且該疾病具有家族性傳遞的可能；此外新生兒馬凡綜合征患兒往往于嬰幼兒期死于嚴重的呼吸循環衰竭，對患兒家屬構成極大地精神打擊。因此，無論對于家族性的馬凡綜合征以及不典型的或者尚未發病的攜帶者，或是對于患有主動脈擴張等心血管畸形的嬰幼兒，我們建議行馬凡綜合征的遺傳學篩查[11]。若遺傳結果為陽性，應與患者及患者家屬在疾病的預后及疾病的進程方面進行有效地溝通，促進醫患的配合并盡最大努力控制疾病的發展，預防嚴重并發癥的發生。

Figure 5.The sequence alignment of FBN1 protein among different species. The results of human, chimpanzee, bovine, rat and mouse were showed. The red frame in the alignment showed the amino acid affected by the mutation.

圖5FBN1突變氨基酸序列的物種保守性比對的結果

由于denovo突變主要有兩種來源可能，即胚胎發育過程中產生的，或為父母生殖細胞嵌合體。生殖細胞嵌合體是指當突變只發生在胚胎早期生殖細胞形成過程中，這種攜帶突變的細胞系只占生殖細胞腺的一部分，機體其它組織細胞不攜帶突變，因此在對外周血提取的基因組中可能不攜帶該突變或該突變攜帶的細胞比例太少不被檢出[10]。對于這類患者家庭，我們建議行相關產前遺傳學診斷。

最后，本研究比較了2個不同的馬凡綜合征家系患者的FBN1基因突變篩查的結果，擴大了FBN1基因的突變譜。初步分析了基因型與表型特點、疾病進程及預后的聯系，為查有新生突變病史的家庭，特別是攜帶新生兒馬凡綜合征突變的患兒家庭，進行早期的確診和干預，并提供遺傳咨詢以及為其后代的臨床及基因檢測提供依據。

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(責任編輯： 林白霜， 羅森)

Twodenovomutations including 1 novel mutation in FBN1 and genotype-phenotype correlation in 2 Chinese Marfan syndrome families

PAN Qi-hao1, 2, LIANG Xiao-bi3, GUO Yong4, ZHU Jun-wen5, HU Bin1, 2, WANG Yi-ming6, 7

(1DepartmentofMedicalGenetics,ZhongshanSchoolofMedicine,2CenterforGenomeResearch,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China;3HeartCenter,GuangzhouWomenandChildren’sMedicalCenter,Guangzhou510120,China;4DepartmentofCriminalInvestigationBrigadeofBaiyunBranch,GuangzhouPublicMunicipalPublicSecurityBureau,Guangzhou510420,China;5HuangpuBranchofGuangzhouPublicMunicipalPublicSecurityBureau,Guangzhou510700,China;6XinhuaCollege,SunYat-senUniversity,Guangzhou510520,China;7BeijingGenomicsInstituteinShenzhen,Shenzhen518083,China.E-mail:ywzhong@hotmail.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the genetic cause of 2 Chinese families with Marfan syndrome. METHODS: The clinical and laboratory investigations were performed in the 2 unrelated Chinese families. Family 1 had 1 patient with cardiac problem. Family 2 had 2 patients: one died, and the other with respiratory and cardiac problems. Next generation sequencing and Sanger sequencing in the Marfan syndrome causal gene FBN1 were performed in the patient, his unaffected sister and the parents of family 1. Sanger sequencing covering all the exons and intron-exon boundaries were performed in the patient and the parents in family 2. Bioinformatic analysis was engaged in the variations unravelled. Fifty healthy individuals were also investigated in the same manner. RESULTS: Both patients were diagnosed with Marfan syndrome. A novel mutation c.4685G>A (p.Cys1562Tyr) was detected in the patient of family 1 but was absent in his parents and the unaffected sister. This is a previously unreported novel mutation. In the mutation a conserved Cys was substituted by a Tyr in amino acid 1562 affecting a TGF-β binding domain and the secondary structure in the encoded protein. We also detected the mutation c.3706T>C (p.Cys1236Arg) in the patient of family 2. It was absent in the unaffected parents, and therefore was a de novo mutation too. This mutation has been previously reported and known to be associated with neonatal Marfan syndrome. Both mutations were absent in the 50 healthy controls. We also compared the genotype and phenotypes of the 2 families. CONCLUSION: We report 2 de novo mutations in 2 Chinese families with Marfan syndrome. One of the 2 mutations is novel. The phenotype of the mutation c.4685G>A(p.Cys1562Tyr) in family 1 is associated with classical Marfan syndrome, while that of c.3706T>C (p.Cys1236Arg) in family 2 is with neonatal type of Marfan syndrome. De novo mutations may be a cause for a proportion of mutations underlying the disease. The novel mutation also expends the mutational spectrum of the FBN1 gene.

[KEY WORDS]Marfan syndrome; FBN1 gene; De novo mutation; Genotype; Phenotype

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.03.023

[中圖分類號]R363

[文獻標志碼]A

通訊作者△Tel： 020-87332055; E-mail： ywzhong@hotmail.com

*[基金項目]國家自然科學基金資助項目(No. 31471193)

[收稿日期]2015- 09- 14[修回日期] 2015- 12- 14

[文章編號]1000- 4718(2016)03- 0527- 07

雜志網址： http://www.cjpp.net