ClC-3基因過表達對小鼠骨量和骨結構的影響*

汪　源，　鄧志欽，　呂瑞玲，　王海波，　高　宏，　梁協稠，　譚秋嬋，　朱林燕，　李青南，　王立偉△，　陳麗新△

(暨南大學醫學院 1生理學系， 2藥理學系，廣東 廣州 510632； 3廣東藥學院生命科學與生物制藥學院，廣東 廣州 510006)

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ClC-3基因過表達對小鼠骨量和骨結構的影響*

汪源1，鄧志欽1，呂瑞玲1，王海波2，高宏2，梁協稠1，譚秋嬋1，朱林燕2，李青南3，王立偉1△，陳麗新2△

(暨南大學醫學院1生理學系，2藥理學系，廣東 廣州 510632；3廣東藥學院生命科學與生物制藥學院，廣東 廣州 510006)

[摘要]目的： 研究過表達電壓門控氯通道家族蛋白成員3(voltage-gated chloride channel family protein 3, ClC-3)基因對小鼠骨骼的影響。方法：3月齡雄性FVB小鼠用鼠尾基因檢測法確定基因型后分為2組：野生型(WT)組和ClC-3過表達(ClC-3 transgene)組，每組各8只。分別測量2組小鼠體重，右側脛骨長度和重量。取脛骨上段和中段進行脫鈣，石蠟包埋，切片，HE染色后，采用骨形態計量學分析脛骨上段松質骨的骨小梁面積百分數(percent trabecular area, %Tb.Ar)、骨小梁數量(trabecular number, Tb.N)、骨小梁寬度(trabecular width, Tb.Wi)、骨小梁分離度(trabecular separation, Tb.Sp)和脛骨中段皮質骨的骨組織總面積(total tissue area, T.Ar)、皮質骨面積(cortical area, Ct.Ar)、皮質骨面積百分數(percent cortical area, %Ct.Ar)、骨髓腔面積(marrow area, Ma.Ar)、骨髓腔面積百分數(percent marrow area, %Ma.Ar)。結果：小鼠經鼠尾基因檢測后確認為野生型或ClC-3過表達型。與WT組相比，ClC-3 transgene組小鼠體重及脛骨長度重量均減小(P<0.05)；松質骨的%Tb.Ar和Tb.Wi均減小(P<0.05)，Tb.Sp增大(P<0.05)，Tb.N的變化無統計學意義；皮質骨的T.Ar、Ct.Ar和%Ct.Ar均減小(P<0.05)，%Ma.Ar增大(P<0.05)，Ma.Ar的變化無統計學意義。結論：ClC-3過表達導致小鼠的皮質骨和松質骨骨量減少，骨結構變差，提示ClC-3可能參與了骨形成和/或骨吸收。

[關鍵詞]電壓門控氯通道家族蛋白成員3； 骨形態計量學； 松質骨； 皮質骨

骨骼是一個不斷更新的系統，新骨的形成與舊骨的吸收處于動態平衡，眾多因素參與了骨的生長及改建[1]。研究表明骨代謝與Ca2+、K+等多種離子通道密切相關，而氯通道作為生物體內最重要的陰離子通道參與多種生理和病理生理過程，其對骨生長的影響已引起了人們的關注。如電壓門控氯通道家族蛋白成員3(voltage-gated chloride channel family protein 3,ClC-3)基因敲除的小鼠表現出生長阻滯及骨骼生長異常[2]，提示ClC-3氯通道與骨代謝有密切關系。

ClC-3氯通道由CLCN3基因編碼，是電壓門控氯通道(voltage-gated chloride channel, ClC)家族中的一員，廣泛分布于腦、腎、心臟、骨骼肌、胰腺和腎上腺等組織。ClC-3在質膜、細胞核、細胞器上都有表達，并且參與了細胞的容積調節、周期調節、凋亡等多種生理活動，在腫瘤的生長和轉移中也有重要作用[3-5]。有報道ClC-3在成骨細胞和破骨細胞上均有表達，且ClC-3通過調節細胞器的酸化作用來參與破骨細胞的骨吸收功能[6]。在小鼠成骨細胞的骨誘導過程中，ClC-3蛋白表達可以通過Runx2基因促進成骨分化[7]。但ClC-3過表達對骨骼的影響目前還不清楚。本研究以ClC-3過表達小鼠為研究對象，觀察脛骨松質骨和皮質骨的骨量與骨結構的變化，以了解ClC-3在小鼠骨生長中的作用。

材料和方法

1實驗材料

鼠尾基因檢測試劑盒購于康為世紀有限公司;Taq酶、DNA marker DL1000、瓊脂糖購于大連寶生物工程有限公司；小鼠鑒定引物和內參照均由Invitrogen合成；固體石蠟、EG1160型石蠟包埋機、RM2255型切片機為Leica產品;Bioquant-Osteo骨形態學圖像分析系統為BIOQUANT產品。

2實驗動物及鑒定

ClC-3過表達轉基因小鼠委托Cyagen Biosciences構建，項目協議編號為TGS120401AH01。質粒名稱為pLV.EX3d.P/neo-EF1A>CLCN3>IRES/eGFP。小鼠品系為FVB。SPF級環境中分籠飼養，室溫22～28 ℃，相對濕度40%～60%，晝夜交替，隔日更換墊料，自由攝食攝水。

剪取4周齡小鼠尾尖0.4 cm～0.6 cm，參照鼠尾DNA提取試劑盒說明書提取基因組DNA后測DNA濃度并將各樣本調至相同濃度，PCR反應擴增clc-3基因。上游引物序列為5′-TTGCCTACTATCACCACGAC-3′，下游引物序列為3′-GCATCTCCAACCCATTTACT-5′，產物大小為440 bp。PCR總體系為50 μL：2×Taq Master Mix 25 μL，PCR引物上、下游引物各1 μL，基因組DNA 1 μL，ddH2O 22 μL。反應條件為：94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s，64 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，循環35次;72 ℃ 2 min，4 ℃保存。取10 μL PCR產物進行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統分析結果。根據該結果將小鼠分為野生型(WT)組和ClC-3過表達(ClC-3 transgene)組，每組各8只，然后繼續飼養至3月齡。

3骨標本脫鈣包埋及制片

小鼠稱重后用戊巴比妥鈉麻醉，再經心臟抽血處死，取右側脛骨稱重測量長度。按圖1所示鋸出上段和中段。10%的EDTA脫鈣約28 d,可以用大頭針輕輕刺進者為脫鈣完全。石蠟包埋后切4 μm薄片，HE染色后顯微鏡下觀察拍照。

Figure 1.The material parts of proximal and middle part of tibia.

圖1脛骨上段和中段取材部位

4骨組織形態計量學檢測

本實驗所有參數采用國際通用標準骨組織形態計量學術語命名，經BIOQUANT OSTEO骨組織形態圖像分析系統測量獲得二維參數如骨小梁總面積，骨小梁面積，骨小梁周長等等，再運用公式進行計算得到三維參數如骨小梁面積百分數，骨小梁數量，骨小梁厚度，骨小梁分離度等等。根據骨組織形態計量學中這些參數的定義和意義對骨量、骨結構等進行分析。

5統計學處理

用Sigma Plot 10.0軟件進行統計分析。數據均采用均數±標準差(mean±SD)表示，t檢驗比較組間差異，以P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1ClC-3過表達小鼠基因型鑒定

本實驗中過表達轉基因小鼠導入質粒為pLV. EX3d. P/neo-EF1A>CLCN3>IRES/eGFP，PCR體系中所設計的引物是從GFP基因開始的，所以在長波紫外光下觀察瓊脂糖凝膠上的PCR條帶時，ClC-3過表達小鼠在440 bp處出現條帶，野生型小鼠在該處不出現條帶，200 bp為內參照，見圖2。

Figure 2.Identification of ClC-3 overexpressed mice. 1: marker; 2～8: ClC-3 overexpressed mice; 9～10: WT mice.

圖2ClC-3過表達小鼠基因型鑒定

2小鼠體重及脛骨長度重量的變化

小鼠麻醉后觀察到ClC-3 transgene組小鼠個頭略小，見圖3。取出脛骨后觀察到ClC-3 transgene組脛骨的長度比WT組的短，見圖4。稱重及測量長度后結果顯示：與WT組相比，ClC-3 transgene組小鼠體重減輕(P<0.05)，且脛骨長度和重量均減少(P<0.05)，見表1。

Figure 3.Morphological comparison of WT and ClC-3 transgene mice.

圖3野生型和ClC-3過表達小鼠的形態比較

Figure 4.Morphological comparison on tibia of WT and clc-3 transgene mice.

圖4野生型和ClC-3過表達小鼠脛骨的形態比較

表1ClC-3過表達對小鼠體重及脛骨長度和重量的影響

Table 1.Effects of ClC-3 overexpression on the body weight and the length and weight of the tibias of mice (Mean±SD.n=8)

GroupBodyweight(g)Weightoftibia(mg)Lengthoftibia(mm)WT23.41±2.3058.30±6.7718.35±1.10ClC-3transgene21.17±3.07*49.27±6.29*16.58±0.91*

*P<0.05vsWT.

3松質骨形態計量學參數的變化

圖5所示為脛骨上段冠狀面HE染色圖，圖中紫紅色條狀部分為骨小梁，其周圍包繞的是骨髓，左右兩邊紫紅色部分為皮質骨。可觀察到WT組骨小梁排列有序密集，骨小梁之間連接較多且間距小；ClC-3 transgene骨小梁變窄，數量減少。骨形態計量學結果顯示：與WT組相比，ClC-3 transgene組小鼠松質骨骨小梁面積百分數(percent trabecular area, %Tb.Ar)、骨小梁寬度(trabecular width, Tb.Wi)均減小(P<0.05)，骨小梁分離度(trabecular separation, Tb.Sp)增加(P<0.05)，骨小梁數目(trabecular number, Tb.N)減小，但其變化無統計學意義，整體表現為骨量減少，骨結構變差，見表2。

Figure 5.Effects of ClC-3 overexpression on the cancellous bone of the proximal tibia in mice (×5). Proximal tibia were dissected, decalcified, paraffin-imbed, sectioned and stained with HE staining. A: WT group; B: ClC-3 transgene group.

圖5ClC-3過表達對小鼠脛骨上段松質骨的影響

表2ClC-3過表達對小鼠脛骨上段松質骨靜態參數的影響

Table 2.Effects of ClC-3 overexpression on the histomorphometric parameters of the cancellous bone of the proximal tibia in mice (Mean±SD.n=8)

Group%Tb.Ar(%)Tb.Wi(μm)Tb.N(mm-1)Tb.Sp(μm)WT14.46±2.4330.56±4.254.74±0.56182.86±24.04ClC-3transgene9.66±2.50*26.12±1.70*3.67±1.20268.54±83.08*

*P<0.05vsWT.

4皮質骨形態計量學參數的變化

圖6所示為脛骨中段橫斷面HE染色圖，圖中外圈紫紅色部分為皮質骨，內圓部分為骨髓腔。可觀察到WT組皮質骨面積百分比較大，ClC-3 transgene組皮質骨面積百分比較小，2組骨髓腔面積大小幾乎沒有差異。骨形態計量學結果顯示：與WT組相比，ClC-3 transgene組小鼠皮質骨的骨組織總面積(total tissue area, T.Ar)、皮質骨面積(cortical area, Ct.Ar)和皮質骨面積百分數(percent cortical area, %Ct.Ar)均減少(P<0.05)，骨髓腔面積百分數(percent marrow area, %Ma.Ar)增大(P<0.05)，見表3。

Figure 6.Effects of ClC-3 overexpression on the cortical bone of the middle part of tibia shaft in mice (×5). Middle part of tibia shaft were dissected, decalcified, paraffin-imbed, sectioned and stained with HE staining. A: WT group; B: ClC-3 transgene group.

圖6ClC-3過表達對小鼠脛骨中段皮質骨的影響

表3ClC-3過表達對小鼠脛骨中段皮質骨靜態參數的影響

Table 3.Effects of ClC-3 overexpression on the histomorphometric parameters of the cortical bone of the tibia shaft (middle part) in mice (Mean±SD.n=8)

GroupT.Ar(mm2)Ct.Ar(mm2)%Ct.Ar(%)Ma.Ar(mm2)%Ma.Ar(%)WT0.95±0.090.67±0.0870.53±1.570.28±0.0229.47±1.38ClC-3transgene0.71±0.06*0.44±0.04*61.97±2.11*0.27±0.0338.03±2.61*

*P<0.05vsWT.

討論

FVB小鼠因其受精卵易于顯微注射DNA而常用于轉基因動物實驗，成熟期為8～10周，3月齡時其性腺與內分泌系統已完全發育成熟，肌肉骨骼系統基本定型。研究發現雌激素水平的下降可導致成骨細胞功能和活性降低，使破骨細胞凋亡受抑制進而造成骨丟失[8-9]。因此本研究為了降低雌激素及年齡對小鼠的影響，選擇了雄性3月齡的FVB小鼠進行研究。

成人的骨骼主要由皮質骨組成，約占80%，構成骨的外層；而松質骨僅占20%，主要位于骨的中心部分。松質骨由分枝的骨小梁構成一個間隙互相連通的錯綜復雜的立體網格，其周圍包繞骨髓。皮質骨結構致密，為堅硬致密的連續體。脛骨由于血供和營養豐富，代謝功能活躍，骨的再生能力強，骨轉化率比較高，是各種骨質疏松模型和防治藥物研究的較理想部位。所以本研究選取脛骨作為研究部位。

骨組織形態計量學是能定量地觀察和研究骨組織形態及其結構的一門體視學技術，是骨質疏松動物實驗及骨質疏松防治藥物藥效試驗中重要的評價指標，是為臨床提供理論指導的重要科研手段[10]。骨小梁面積百分數能反映骨量的多少，是評價骨量變化的最重要的指標。骨小梁厚度和骨小梁數量用于描述骨小梁形態結構，它們與骨量的變化呈正相關。骨小梁分離度指骨小梁之間的平均距離，分離度越大骨就越疏松。皮質骨骨組織總面積指整個橫斷面面積，代表骨外膜形成的情況。皮質骨面積反映皮質骨骨量的多少，能綜合反映內外骨面的變化。皮質骨面積百分數是指皮質骨占總面積的百分比。骨髓腔面積反映骨內膜骨吸收的情況，增大表示骨吸收增加或骨形成的減少，不變化表示骨吸收和骨形成達到動態平衡，縮小表示骨吸收減少或骨形成增加。骨髓腔面積百分數是指骨髓腔占總面積的百分比。

已有研究報道ClC-3基因缺陷的小鼠表現為生長遲緩，體重減輕，比野生型的個頭小[2]。而本實驗結果顯示ClC-3過表達小鼠體重減輕，這可能因為機體ClC-3表達差異導致生長受到抑制，并且脛骨重量減小也是體重減輕的一個重要原因。提示ClC-3缺失或過多均不利于小鼠的生長發育，ClC-3在一定范圍內適量的表達才能使小鼠正常生長發育。

本實驗結果顯示，ClC-3過表達小鼠脛骨上段松質骨的%Tb.Ar和Tb.Wi均減小，Tb.Sp增大，Tb.N的變化沒有統計學意義。說明ClC-3過表達使小鼠松質骨的骨微化結構發生退化，骨量和骨結構均出現了改變，且ClC-3過表達主要是減小骨小梁寬度從而使骨量減少，而對骨小梁的的數目影響較小。破骨細胞發揮的破骨作用和成骨細胞發揮成骨作用是相互聯系的[11-12]，提示ClC-3過表達使成骨細胞的骨重建與破骨細胞骨吸收的平衡被打破，繼而導致骨丟失。同時本研究表明，ClC-3過表達小鼠皮質骨的T.Ar 和%Ct.Ar均減小，%Ma.Ar增大，提示ClC-3過表達也降低了小鼠皮質骨骨量，這可能與皮質骨內外膜的骨吸收增加和骨形成減少有關。

綜上所述，ClC-3過表達對小鼠的松質骨和皮質骨的骨量和骨結構都有影響，骨骼質量下降，提示ClC-3可能參與了機體的骨吸收和/或骨形成的調節過程，具體機制還有待進一步研究。

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(責任編輯： 林白霜， 余小慧)

Effects ofClC-3 gene overexpression on bone mass and structure in mice

WANG Yuan1, DENG Zhi-qin1, Lü Rui-ling1, WANG Hai-bo2, GAO Hong2, LIANG Xie-chou2, TAN Qiu-chan1, ZHU Lin-yan2, LI Qing-nan3, WANG Li-wei1, CHEN Li-xin2

(1DepartmentofPhysiology,2DepartmentofPharmacology,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China;3SchoolofLifeScienceandBiopharmacy,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China.E-mail:tchenlixin@jnu.edu.cn;twangliwei@jnu.edu.cn)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the effect of the overexpression of voltage-gated chloride channel family protein 3 (ClC-3) gene on bones of mice. METHODS: The tail gene detection assay was used to confirm the overexpression of ClC-3. The male FVB mice of three months old were divided into two groups, the wild type (WT) group and the ClC-3 overexpressed (ClC-3 transgene) group. The body weight, length and weight of the right tibias were measured. The upper and middle parts of the tibias were dissected, decalcified, paraffin-imbed, sectioned and stained with HE staining. The bone morphology metrology was used to analyze the changes of bone structures. The percent trabecular area (%Tb.Ar), trabecular number (Tb.N), trabecular width (Tb.Wi) and trabecular separation (Tb.Sp) of cancellous bone in the upper part of the tibia were measured. The total tissue area (T.Ar), cortical area (Ct.Ar), percent cortical area (%Ct.Ar), marrow area (Ma.Ar) and percent marrow area (%Ma.Ar) of the cortical bone in the middle part of the tibia were detected . RESULTS: The wild type mice and the ClC-3-overexpressed mice were verified by the tail gene detection assay. Compared with WT group, the body weight and the length and weight of the tibia were decreased in ClC-3 transgene mice (P<0.05). In the cancellous bones of ClC-3 transgene mice, the %Tb.Ar and Tb.Wi were decreased (P<0.05), the Tb. Sp was increased (P<0.05) and the Tb. N was not significantly changed. In the cortical bones of ClC-3 transgene mice, the T.Ar, Ct. Ar and %Ct.Ar were decreased (P<0.05), the % Ma.Ar was increased (P<0.05), and the Ma.Ar was not significantly changed. CONCLUSION: ClC-3 overexpression may lead to the reduction of the bone mass and the destructure of the cancellous and cortical bones. The results suggest that ClC-3 may be involved in the regulation of bone resorption and/or formation.

[KEY WORDS]ClC-3; Bone morphometry; Cancellous bone; Cortical bone

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.03.018

[中圖分類號]R336; R363

[文獻標志碼]A

通訊作者△陳麗新Tel: 020-85228865; E-mail: tchenlixin@jnu.edu.cn; 王立偉Tel: 020-85226565; E-mail: twangliwei@jnu.edu.cn

*[基金項目]國家自然科學基金資助項目(No.81273539; No.81272223; No.81173064)；教育部基金資助項目(No.20124401110009);廣州市科技計劃基金項目(No.2013J450015);廣東省科技計劃項目(No.2013B051000059)

[收稿日期]2015- 11- 16[修回日期] 2016- 01- 04

[文章編號]1000- 4718(2016)03- 0499- 05

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