SphK1和FAK對人結腸癌HCT116細胞上皮間質轉化的影響*

諸葛春鳳，　劉詩權，　譚　林，　覃蒙斌，　梁夢紫，　黃杰安

(廣西醫科大學第一附屬醫院消化內科，廣西 南寧 530021)

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SphK1和FAK對人結腸癌HCT116細胞上皮間質轉化的影響*

諸葛春鳳，劉詩權△，譚林，覃蒙斌，梁夢紫，黃杰安

(廣西醫科大學第一附屬醫院消化內科，廣西 南寧 530021)

[摘要]目的： 研究鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase l，SphK1)和黏著斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)對人結腸癌HCT116細胞上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的影響。方法: 將人結腸癌HCT116細胞分成3組：采用SphK1抑制劑N, N-二甲基鞘胺醇(N，N-dimethylsphingosine，DMS)、FAK抑制劑PF573228和相同體積的培養基分別處理細胞。MTT法檢測細胞活力，Western blot方法檢測SphK1、FAK、E-cadherin、N-cadherin、vimentin和基質金屬蛋白酶 2(MMP2)蛋白的表達,real-time PCR檢測SphK1、鞘氨醇1-磷酸(S1P)、FAK、E-cadherin 和vimentin mRNA的表達，并應用細胞劃痕實驗檢測腫瘤細胞的遷移能力。結果: PF573228和DMS均明顯抑制人結腸癌HCT116細胞的活力, 并呈時間劑量依賴性。DMS抑制SphK1的表達，同時下調FAK、N-cadherin、vimentin和MMP2蛋白的表達，而上調E-cadherin蛋白表達上調。PF573228明顯抑制FAK的表達，同時抑制SphK1、N-cadherin、vimentin和MMP2的表達，上調E-cadherin蛋白的表達(P<0.01)。劃痕實驗顯示PF573228和DMS顯著抑制HCT116細胞的遷移能力(P<0.01)。與對照組比較，PF573228組和DMS組FAK、SphK1、S1P以及vimentin mRNA的表達明顯下調，而E-cadherin mRNA的表達則明顯上調(P<0.05)。結論: SphK1和FAK信號通路可能在結腸癌HTC116細胞上皮間質轉化過程中發揮重要作用。

[關鍵詞]鞘氨醇激酶1； 黏著斑激酶； 上皮間質轉化； 人結腸癌細胞

結腸癌發生侵襲、轉移是影響結腸癌預后的關鍵因素，是導致患者死亡的主要的原因[1]，越來越多的研究發現上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在腫瘤發生、發展及轉移過程中扮演了至關重要的角色[2]。然而，EMT在結腸癌中的作用及其機制尚不明確。

黏著斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)是一種非受體分子量為125 kD的蛋白酪氨酸激酶，在結構上分為4個功能域：在N端附近的FERM區域、中央催化激酶域、3個富含脯氨酸的區域PRⅠ、PRⅡ、PRⅢ和在C末端附近的黏著斑目標域，FAK的羧基端存在多個位點，可與細胞骨架蛋白和信號轉導蛋白結合，其功能可能是將多種蛋白聚集在一起而發揮其生物學功能。研究發現FAK在包括結腸癌在內的腫瘤細胞的黏附、侵襲、轉移及EMT中均發揮了重要的作用[3-4]。對結腸癌的研究發現下調FAK或使用FAK抑制劑，可增強E-cadherin的表達并增加細胞的黏附性，同時抑制腫瘤細胞擴散轉移[5]。表明FAK可能參與了結腸癌細胞EMT的發生，但其機制目前尚不明確。我們以前的研究發現鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase 1，SphK1)可調控FAK在結腸癌細胞中的表達而參與腫瘤細胞的侵襲和轉移[6]。因此，SphK1和FAK可能在結腸癌EMT發生過程中發揮重要作用。

本研究中，我們采用SphK1抑制劑DMS和FAK抑制劑PF573228調控結腸癌HCT-116細胞SphK1和FAK的表達，觀察細胞的增殖、遷移以及對EMT相關標志物表達的影響，了解SphK1和FAK對結腸癌細胞EMT的影響及其機制。

材料和方法

1主要材料和試劑

結腸癌HCT116細胞購自中國科學院細胞庫；四氮唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)、SphK1抑制劑N,N-二甲基鞘胺醇(N，N-dimethylsphingosine，DMS)購自Sigma；FAK抑制劑PF573228(Selleck)；兔抗人GAPDH、E-cadherin、N-cadherin和FAK單克隆抗體購自CST；兔抗人vimentin和基質金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP2)單克隆抗體購自Proteintech；RNAsio、逆轉錄聚合酶鏈反應試劑和SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)購自Roche；IRDye800標記的羊抗兔 II 抗(LiCor)；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)購自ExCell；DMEM高糖培養基購自Gibco。

2方法

2.1細胞培養人結腸癌HCT116細胞株用含10%胎牛血清的培養液培養于5%CO2、37℃的細胞培養箱中，細胞在培養瓶中長滿約90%時傳代。傳代時常規吸去培養液，PBS潤洗3遍后用0.25%的胰蛋白酶消化，按所需細胞密度接種，取對數生長期細胞用于實驗。

2.2MTT法測定HCT116細胞的細胞活力取對數生長期細胞制成細胞懸液, 細胞密度調整為1.5×107/L, 接種至96孔板，每孔200 μL(3 000個細胞)，實驗分control組、FAK抑制組和Sphk1抑制組，每組重復3孔。置于恒溫培養箱培養，培養12 h，細胞貼壁后，藥物處理。FAK抑制劑PF573228濃度分別為1、10、20和30 μmol/L，處理0 h、24 h、48 h和72 h；Sphk1抑制劑DMS濃度分別為1、5、10和15 μmol/L, 處理0 h、6 h、12 h、24 h、48 h，每孔加入MTT 20 μL(5 g/L), 繼續避光培養4 h，檢測時棄上清，加入二甲基亞砜(DMSO)150 μL，避光振蕩 10 min，上酶標儀，在490 nm波長處測定吸光度(A)值, 以空白試劑組為對照，計算細胞生存率，細胞生存率(%)=(加藥孔A值/對照孔A值)×100%，重復實驗3次。

2.3Real-time PCR檢測mRNA的表達藥物處理細胞48 h后，用 RNAsio提取細胞總RNA，并采用分光光度計檢測RNA濃度及純度。取1μg總RNA按逆轉錄說明書合成cDNA備用。以GAPDH作為內參照，每組設3個復孔。GAPDH的上游引物序列為5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’，下游引物序列為5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’；SphK1的上游引物序列為5’-GGCTTCATTGCTGATGTGGA-3’，下游引物序列為5’-AGGAAGGTGCCCAGAGTGAA-3’；鞘氨醇1-磷酸(sphingosine-1-phosphate)(S1P)的上游引物序列為5’-GGACTTCATGGATCATCCGTTTG-3’，下游引物序列為5’-CCATTTGATCAGCAGGGTTATTCAG-3’；FAK的上游引物序列為5’-CAACCACCTGGGCCAGTATTATC-3’，下游引物序列為5’-CCATAGCAGGCCACATGCTTTA-3’；E-cadherin的上游引物序列為5’-GAGTGCCAACTGGACCATTCAGTA-3’，下游引物序列為5’-AGTCACCCACCTCTAAGGCCATC-3’。數據采用相對雙ΔCt法，按公式2-ΔΔCt行定量分析。

2.4Western blot法檢測蛋白的表達分組處理細胞繼續培養48 h后提取總蛋白，BCA法測蛋白含量。各組取200 μg蛋白上樣，聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉移至PVDF膜，用含50 g/L脫脂奶粉配置的牛奶封閉1 h后4 ℃下 I 抗孵育過夜，次日室溫孵育熒光 II 抗1 h，應用Odyssey 3.0儀器掃膜顯影，使用Quantity-one軟件分析灰度值。以GAPDH為內參照，蛋白相對表達強度=目的蛋白A值/內參照A值。

2.5劃痕實驗檢測細胞遷移能力分組處理細胞分別制備成單細胞懸液，以每孔5×104個分別接種到6孔板，每組細胞設3個復孔。5% CO2、37 ℃孵育24 h，用高壓消毒過的200 μL移液器槍頭于6孔板底部劃“一”字痕，PBS沖洗3遍，徹底洗脫劃下細胞。加入新鮮無血清培養液分別培養至0 h、24 h和48 h后，在倒置相差顯微鏡觀察劃痕邊緣細胞遷移情況并拍照，應用Photoshop圖像處理軟件分析細胞遷移程度。

3統計學處理

應用 SPSS 16.0統計學軟件進行數據分析，以上實驗均重復3次，計量資料以均數±標準差(mean±SD)表示，組間比較采用t檢驗或是單因素方差分析(one-way ANOVA)，各組間均數差異采用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1PF573228和DMS對HCT-116細胞mRNA表達的影響

與對照組比較，PF573228組和DMS組FAK、 SphK1、S1P和vimentin的mRNA表達顯著下降(P<0.05)，而E-cadherin的mRNA表達則顯著上調(P<0.05)，見表1。

表1各組mRNA的相對表達量

Table 1.The relative mRNA expression in human colon cancer HCT116 cells (Mean±SD.n=3)

NameControlPF573228DMSSphK11.000.21±0.08**0.55±0.10**FAK1.000.16±0.01**0.38±0.03**S1P1.000.08±0.01**0.30±0.06**E-cadherin1.001.56±0.21*2.39±0.30**Vimentin1.000.24±0.08**0.30±0.06**

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

2PF573228和DMS對HCT-116細胞存活率的影響

PF573228和DMS對HCT-116細胞存活率均具有抑制作用, 并呈時間劑量依賴性，見圖1。

Figure 1.The effects of PF573228 (A) and DMS (B) on the cell viability. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖1PF573228和DMS對HCT-116細胞生存率的影響

3FAK、SphK1、MMP2以及EMT相關蛋白的表達

Western blot結果顯示HCT-116細胞中存在FAK、SphK1、侵襲相關蛋白MMP2以及EMT相關指標(N-cadherin、E-cadherin、vimentin)的蛋白表達基礎，與control組比較，DMS抑制SphK1、FAK、N-cadherin、vimentin和MMP2蛋白的表達，而上調E-cadherin蛋白表達。PF573228明顯抑制FAK、SphK1、N-cadherin、vimentin和MMP2的表達，但上調E-cadherin蛋白的表達(P<0.01)，見圖2。

Figure 2.The effects of PF573228 and DMS on the protein expression of SphK1， FAK, E-cadherin, N-cadherin, vimentin and MMP2 in colon cancer HCT116 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖2PF573228和DMS對FAK、SphK1、N-cadherin、E-cadherin、vimentin和MMP2蛋白表達的影響

4細胞遷移能力的比較

如圖3所示，在3組細胞內劃出相同寬度的痕跡，0 h、24 h、48 h后觀察細胞劃痕處的遷移情況，48 h時control組細胞遷移距離為(139.95±13.40)μm，PF573228組為(42.95±12.18)μm，DMS組為(50.09±9.70)μm，可見PF573228和DMS組較對照組的細胞遷移速度慢，提示PF573228和DMS能抑制細胞的遷移能力(P<0.01)。

討論

我國大腸癌發病率和死亡率位居全部惡性腫瘤的第4位[7]。我國結腸癌發病率呈現逐漸上升趨勢，治療結腸癌的關鍵環節之一是找到觸發其發生發展的始動因素，隨著分子靶向治療研究的逐漸深入，越來越多與腫瘤有關通路的分子靶向治療的出現使結腸癌有了新的治療手段。目前，阻斷結腸癌轉移是治療結腸癌的的關鍵。而大量的研究顯示，上皮間質轉化在腫瘤發生、侵襲和轉移中扮演了至關重要的角色[2]。 EMT是指在生理和病理情況下具有極性的上皮細胞失去極性，黏附能力下降，從而極易脫離周圍細胞而發生遷移和轉移，并轉化為具有間質表型的細胞過程[8]。EMT不僅包括細胞形態學的改變，還包括以下標志物表達的改變：上皮細胞標志性蛋白E-cadherin 表達減少或失表達，間質標志性物(如N-cadherin、vimentin、fibronectin等)和某些轉錄因子(如Twist、Slug、Snail等)表達上調[9]。同時，研究顯示發生EMT的腫瘤細胞中基質金屬蛋白酶分泌可增高[10]。研究顯示EMT在促進乳腺癌、卵巢癌、結腸癌、肺癌和肝癌等多種細胞株的侵襲遷移中發揮重要作用[11-15]。

FAK是細胞胞質中一種重要的非受體蛋白酪氨酸激酶，在細胞骨架重組和調節腫瘤侵襲轉移中扮演重要的角色。FAK分子氨基端含有同整合素β亞單位、細胞骨架蛋白和信號傳導蛋白結合的位點，與整合素等介導的信號傳導物質結合從而發揮調節一系列包括細胞黏附、遷移、骨架重組、增殖等作用。本研究也證實 PF573228抑制FAK的表達并明顯抑制結腸癌細胞的活力。此外，Lark等[16]研究發現，FAK在已發生轉移的結腸癌組織表達明顯升高，我們實驗組研究也發現 FAK在結腸癌組織表達相比癌旁組織表達升高，且FAK和p-FAK在癌組織的蛋白水平增高與腫瘤的分化程度、Dukes’分期、淋巴結及遠處轉移密切相關[17]。Chen等[5]研究表明姜黃素能抑制S1P、FAK和CD24，上調E-cadherin的表達而抑制EMT的發生。在大腸癌SW480的研究中，敲除FAK基因，并將細胞移植到裸鼠體內成瘤，結果顯示瘤體明顯減小[18]。本研究使用FAK抑制劑PF573228特異性地抑制FAK活性，而引起間質標志物N-cadherin 、vimentin的下調，而在侵襲轉移中起關鍵作用的上皮標志物E-cadherin表達增加，表明FAK在調控結腸癌細胞EMT中可能發揮重要作用。

Figure 3.The effects of PF573228 and DMS on the migration of colon cancer HCT116 cells (×100). Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖3各實驗組細胞的遷移情況

此外，研究表明FAK信號通路在促進MMPs的分泌，尤其是調節MMP2和MMP9的分泌中發揮重要的作用，MMPs是EMT間質性標志分子，能破壞細胞外基質，誘導血管生成，從而引起腫瘤細胞的增殖和浸潤[19]。本研究顯示抑制FAK的表達，MMP2的表達也明顯減弱，表明FAK調控MMP2可能與結腸癌EMT密切相關。

SphK1是鞘脂代謝平衡的關鍵酶，通過激活催S1P，降低神經酰胺和鞘氨醇，從而促進細胞存活和增殖。研究發現，過表達SphK1能引起非小細胞肺癌A549細胞侵襲轉移能力明顯增強，并且下調E-cadherin, 而上調fibronectin和vimentin表達，從而促進EMT的發生[20]。而在肝癌細胞的研究中發現，HepG2細胞中的SphK1高表達，使用SphK1的抑制劑抑制SphK1時發現FAK的表達減少，腫瘤細胞的侵襲轉移能力減弱，說明SphK1可能通過作用于FAK信號通路增強了腫瘤遠處轉移的能力[21]。但在結腸癌中，有關SphK1信號通路是否參與了EMT發生的研究甚少。此外，有研究發現激活SphK1活性可上調FAK及其磷酸化水平，表明SphK1可能通過調控FAK通路而引起結腸癌發生侵襲轉移[22]。本研究發現抑制SphK1可致EMT相關上皮標志物E-cadherin表達增加，FAK及間質標志物N-cadherin、vimentin等表達減少或缺失，同時腫瘤細胞的遷移能力明顯受到抑制，結果表明SphK1可能參與了HCT16結腸癌細胞EMT的發生，并可能通過作用于FAK的羧基端而調控FAK的表達。然而，研究還發現抑制FAK同時SphK1的表達也受到抑制，表明FAK與SphK1之間可能存在負反饋調節。綜上所述，SphK1和FAK通路可能相互作用共同參與結腸癌細胞上皮間質轉化。

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(責任編輯： 林白霜， 余小慧)

Effects of SphK1 and FAK on epithelial-mesenchymal transition in colon cancer HCT116 cells

ZHUGE Chun-feng, LIU Shi-quan, TAN Lin, QIN Meng-bin, LIANG Meng-zi, HUANG Jie-an

(DepartmentofGastroenterology,FirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China.E-mail:poempower@163.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the effects of sphingosine kinase l (SphK1) and focal adhesion kinase (FAK) on the epithelial-mesenchymal transition (EMT) of human colon cancer HCT116 cells. METHODS: Human colon cancer HCT116 cells were divided into 3 groups. N, N-dimethylsphingosine (DMS) was used to suppress the activity of SphK1. PF573228 was used to suppress the activation of FAK. The cells treated with equal volume of culture medium severed as control group. The cell viability was measured by MTT assay. The protein expression of SphK1, FAK and the EMT relative protein E-cadherin, N-cadherin, vimentin and matrix metalloproteinase (MMP) 2 was analyzed by Western blot. The mRNA expression of SphK1, sphingosine-1-phosphate (S1P), FAK, E-cadherin and vimentin was detected by real-time PCR. The ability of tumor cell migration was measured by wound-healing assay. RESULTS: The cell viability of HCT116 cells was suppressed by DMS and PF573228 in dose and time dependent manners. DMS significantly suppressed the expression of SphK1, FAK, N-cadherin, vimentin and MMP2, meanwhile enhanced the expression of E-cadherin. PF573228 reduced the expression of FAK , SphK1, N-cadherin, vimentin and MMP2, meanwhile increased the expression of E-cadherin (P<0.01). In addition, the migration ability of HCT116 cells was significantly decreased by treating with DMS and PF573228 (P<0.01). Compared with control group, the mRNA expression of FAK, SphK1, S1P and vimentin was decreased, while the expression of E-cadherin was increased significantly in PF573228 group and DMS group (P<0.05). CONCLUSION: SphK1 and FAK signaling pathways may play an important role in the occurrence of EMT in the colon cancer HCT116 cells.

[KEY WORDS]Sphingosine kinase 1; Focal adhesion kinase; Epithelial-mesenchymal transition; Human colon cancer cells

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.03.009

[中圖分類號]R730.23

[文獻標志碼]A

通訊作者△Tel: 0771-5356501；E-mail: poempower@163.com

*[基金項目]國家自然科學基金資助項目(No.81460380)；廣西自然科學基金資助項目(No. 2011GXNSFA018182)；廣西衛生廳基金資助項目(No. GZKZ10-107)

[收稿日期]2015- 08- 10[修回日期] 2015- 12- 24

[文章編號]1000- 4718(2016)03- 0439- 06

雜志網址： http://www.cjpp.net