嬰幼兒重癥和非重癥肺炎淋巴細(xì)胞亞群的差異分析①

龍思琪　馬　莉　陳　敏　李　虹

(貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院中心實驗室，貴陽550004)

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嬰幼兒重癥和非重癥肺炎淋巴細(xì)胞亞群的差異分析①

龍思琪馬莉陳敏②李虹

(貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院中心實驗室，貴陽550004)

[摘要]目的：觀察重癥肺炎和非重癥肺炎患兒淋巴細(xì)胞亞群水平，探討患兒的細(xì)胞免疫功能變化并為臨床治療提供參考。方法：收集重癥肺炎患兒27例、非重癥肺炎(普通肺炎)患兒28例以及20例健康對照，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測研究對象外周血中CD3+T、CD3+CD4+T、CD3+CD8+T、CD19+B、CD16+CD56+NK細(xì)胞的水平，并進行比較分析。結(jié)果：重癥肺炎組CD3+T、CD3+CD4+T、CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞比例明顯低于健康對照(P<0.01，P<0.05，P<0.01，P<0.05)，而CD4/CD8比值、CD19+B淋巴細(xì)胞比例則顯著高于健康對照組(P<0.05，P<0.01)；非重癥肺炎組CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞低于健康對照(P<0.01)，而CD19+B淋巴細(xì)胞比例則顯著高于健康對照組(P<0.01)；與非重癥肺炎組相比，重癥肺炎組CD3+T、CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞比例顯著降低(P<0.01)，而CD19+B淋巴細(xì)胞比例則明顯升高(P<0.01)。結(jié)論：重癥與非重癥肺炎患兒機體存在明顯的細(xì)胞免疫功能紊亂，重癥肺炎患兒的細(xì)胞免疫功能受損更為嚴(yán)重，為臨床評估病情及免疫治療提供一定的理論依據(jù)。

[關(guān)鍵詞]重癥肺炎；T淋巴細(xì)胞亞群；CD19+B淋巴細(xì)胞；細(xì)胞免疫功能

肺炎是兒科的常見病，重癥肺炎或可由于肺炎治療不及時而導(dǎo)致，占肺炎7%～13%[1]，其起病快、并發(fā)癥多、常累及全身，是引起嬰幼兒死亡的主要原因[2]。嬰幼兒免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完全，監(jiān)測淋巴細(xì)胞亞群變化，可反映嬰幼兒體內(nèi)細(xì)胞免疫功能狀態(tài)。本文旨在探討重癥與非重癥肺炎患兒的免疫功能變化，為臨床評估病情嚴(yán)重程度變化及指導(dǎo)治療提供參考價值。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1倫理聲明本研究符合《赫爾辛基宣言》，并通過貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)并出示證明。所有研究對象家長均知情同意。

1.1.2一般資料選擇2014年4月至2015年6月的貴陽市兒童醫(yī)院收治重癥肺炎患兒27例，其臨床診斷符合2005年中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會《2005年全國小兒社區(qū)獲得性呼吸道感染專題研討會紀(jì)要》、《醫(yī)院獲得性肺炎診斷和治療指南》中重癥肺炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]，其中男21例，女6例；年齡1～36月；同時入選同期住院治療的28例非重癥肺炎患兒，其中男24例，女4例；年齡1～48月。重癥肺炎組與非重癥肺炎組均排除近兩周使用免疫調(diào)節(jié)藥物及其他先天性免疫缺陷疾病史，且均無心、腦及肝腎等重要器官疾病。另選同期兒保門診經(jīng)體檢為健康正常小兒20例為健康對照組，三組性別、年齡資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集抽取1～2 ml空腹靜脈血，EDTA抗凝，顛倒混勻。

1.2.2主要儀器與試劑FACS-Canto II(美國BD公司)；六色TBNK檢測試劑盒(美國BD公司)[Percp-cy5.5-CD45、FITC-CD3、Apc-cy7-CD4、Pe-cy7-CD8、Pe-CD16+56、Apc-CD19]；溶血素(美國BD公司)；PBS(磷酸鹽緩沖液)。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測取100 μl新鮮抗凝全血，加入含20 μl抗體的BD上樣管中，震蕩混勻，室溫避光孵育15 min，加入800 μl 1×的免洗溶血素溶血，樣本溶血充分后待上機。運行FACSDIVA軟件，調(diào)節(jié)電壓和熒光補償在最佳狀態(tài)，上樣并分析。

2結(jié)果

2.1三組研究對象T淋巴細(xì)胞亞群水平應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測了對照組(Health comparison，HC組)、非重癥肺炎組(Non-severe pneumonia，NSP組)和重癥肺炎組(Severe pneumonia，SP組)的淋巴細(xì)胞各亞群(見圖1)。SP組CD3+T、CD3+CD4+T、CD3+CD8+T顯著低于HC組(P<0.01，P<0.05，P<0.01)，而CD4/CD8比值明顯高于HC組(P<0.05)，見表1和圖2A～D。與NSP組相比，SP組CD3+T、CD3+CD8+T細(xì)胞比例顯著下降(P<0.01)，見表1和圖2A、C。NSP組CD3+T、CD3+CD4+T細(xì)胞水平低于HC組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但NSP組CD3+CD8+T細(xì)胞水平明顯低于HC組(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表1和圖2A～C。

圖1　流式細(xì)胞術(shù)檢測重癥肺炎、非重癥肺炎及健康對照組外周血中CD3+T、CD3+CD4+T、CD3+CD8+T、CD19+B、CD16+56+NK 細(xì)胞Fig.1　Flow cytometry analysis of frequency of peripheral blood CD3+T,CD3+CD4+T,CD3+CD8+T,CD19+B,CD16+56+NK cells in HC,NSP and SP groups

GroupsnCD3+CD3+CD4+CD3+CD8+CD19+BNKCD4/CD8HCgroup2070.18±4.3040.66±4.5330.40±3.3610.14±2.4210.32±2.311.49±0.31NSPgroup2864.41±8.9636.43±8.8924.26±6.391)25.31±8.771)7.04±6.481.72±0.90SPgroup2752.14±15.511)3)31.52±13.532)18.20±6.691)3)35.94±16.541)3)6.54±6.742)2.06±1.232)

Note：Compared with HC，1)P<0.01，2)P<0.05；compared with NSP，3)P<0.01.

圖2　HC、NSP和SP組CD3+T、CD3+CD4+T、CD3+CD8+T、CD19+B、CD16+56+NK細(xì)胞及CD4/CD8比值的比較Fig.2　Comparison of percentage of CD3+T,CD3+CD4+T,CD3+CD8+T,CD19+B,CD16+56+NK cells and CD4/CD8 among HC,NSP and SP groupsNote: A.The comparison of the percentage of CD3+T cells;B.The comparison of the percentage of CD3+CD4+T cells;C.The comparison of the percentage of CD3+CD8+T cells;D.The comparison of CD4/CD8;E.The comparison of the percentage of CD19+B cells;F.The comparison of the percentage of CD16+56+NK cells.

2.2三組研究對象CD19+B、NK細(xì)胞的水平NSP和SP組CD19+B細(xì)胞水平顯著高于HC組(P<0.01)，且SP組明顯高于NSP組(P<0.01)，見表1和圖2E。SP組與NSP組比較NK細(xì)胞水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但與HC組相比，SP組NK細(xì)胞水平顯著降低(P<0.05)，見表1和圖2F。

3討論

目前研究指出，嬰幼兒肺炎的發(fā)病機制不僅與病原體直接侵害有關(guān)，與機體免疫功能尚有密切聯(lián)系，嬰幼兒的免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善，抵御外界致病原入侵的能力較弱，這為外界病原菌如支原體、病毒、細(xì)菌的直接入侵創(chuàng)造了有利條件，入侵的病原菌可進一步破壞患者體內(nèi)的T淋巴細(xì)胞平衡[4]，損害機體免疫功能。人體外周血中淋巴細(xì)胞亞群主要包括了T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞，它們相互協(xié)調(diào)、制約，共同維持機體免疫穩(wěn)態(tài)，一旦機體受到外界病原菌感染導(dǎo)致免疫系統(tǒng)失調(diào)時，各淋巴細(xì)胞亞群的數(shù)量及功能均會發(fā)生異常，以致免疫功能降低從而引起疾病的發(fā)生與發(fā)展。T淋巴細(xì)胞是反映機體免疫功能的重要指標(biāo)，具有多種生物學(xué)功能，如直接殺傷靶細(xì)胞、輔助B細(xì)胞體液免疫及分泌細(xì)胞因子間接作用于靶細(xì)胞，維持機體免疫平衡的重要意義。CD3+T淋巴細(xì)胞代表了所有的成熟T細(xì)胞及機體細(xì)胞免疫的基礎(chǔ)，根據(jù)表面CD分子表達不同分為CD3+CD4+T和CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞，CD3+CD4+T細(xì)胞為輔助性T細(xì)胞，可通過釋放多種因子激活B細(xì)胞和效應(yīng)T細(xì)胞來上調(diào)機體的免疫功能[5,6]，CD4+T淋巴細(xì)胞的減少會使人體逐漸喪失對抗原的免疫反應(yīng)。有學(xué)者指出，CD4+T淋巴細(xì)胞肺內(nèi)發(fā)揮尤其重要的功能。研究報道，在感染的肺組織中，CD4+T淋巴細(xì)胞可提高吞噬細(xì)胞活性，加強B細(xì)胞反應(yīng)，并促進CD8+T淋巴細(xì)胞擴增，對保持CD8+T淋巴細(xì)胞監(jiān)控和殺傷功能有重要作用[7]。而CD3+CD8+T細(xì)胞即為抑制性/細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞具有抑制機體免疫應(yīng)答或細(xì)胞毒的功能[8]。正常情況下，CD4+T細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞相互制約，以產(chǎn)生適度的免疫應(yīng)答，使之既能清除異物又不致?lián)p傷機體自身組織，處于動態(tài)平衡的狀態(tài)，以維持機體免疫功能的穩(wěn)定[9]。本研究結(jié)果顯示，無論是重癥肺炎還是非重癥肺炎患兒體內(nèi)的CD3+T、CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞水平均出現(xiàn)了不同程度的降低，這與國內(nèi)學(xué)者研究結(jié)果趨勢一致[10,11]。與健康對照組比較，重癥肺炎組CD3+T、CD3+CD4+T及CD3+CD8+T下降顯著(P<0.01、P<0.05、P<0.01)，以CD3+CD8+T細(xì)胞減少尤為突出，三組間相互比較均有顯著差異(P<0.01)。重癥肺炎患兒CD3+T、 CD3+CD4+T、CD3+CD8+T細(xì)胞顯著下降說明機體T淋巴細(xì)胞的功能有整體受到抑制的可能，CD4+輔助性T細(xì)胞促進細(xì)胞免疫及體液免疫的作用減弱，尤其CD8+抑制性T細(xì)胞的抑制免疫細(xì)胞的增殖與分化的功能亦被削弱得更加明顯。與重癥肺炎不同的是，非重癥肺炎與健康對照組比較CD3+T、 CD3+CD4+T減少并不明顯，而CD3+CD8+T細(xì)胞比例已顯著下降，提示非重癥肺炎患兒T細(xì)胞的抑制和細(xì)胞毒功能已有明顯減弱的可能，從而造成機體未能及時有效地清除帶有致病原的細(xì)胞，給致病原的傳播創(chuàng)造了有利條件，間接引起病情惡化。

本次研究觀察到重癥肺炎組CD4/CD8比值較健康對照顯著升高，這與Zhu等[12]的研究結(jié)果不同，Zhu等研究指出支氣管肺炎患兒的CD4/CD8比值與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，分析之所以結(jié)果出現(xiàn)差異與兩次研究患兒入選組別標(biāo)準(zhǔn)不盡相同有關(guān)，本研究患兒的分組依據(jù)按照2005年中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會《2005年全國小兒社區(qū)獲得性呼吸道感染專題研討會紀(jì)要》、《醫(yī)院獲得性肺炎診斷和治療指南》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]，而Zhu等患兒分組依據(jù)按WHO肺炎及重癥肺炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)[13]，這可能引起兩次研究入選同一組別的患兒病情程度卻不一致，從而出現(xiàn)不同研究結(jié)果。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)肺炎組與重癥肺炎組較對照組CD19+B淋巴細(xì)胞比例均顯著上升，且重癥肺炎組顯著高于肺炎組。提示患兒有B淋巴細(xì)胞活化，產(chǎn)生抗體的能力增強，介導(dǎo)體液免疫抵御外界病原菌的可能。但由于大多數(shù)B淋巴細(xì)胞在抗原刺激后，需在CD4+T細(xì)胞的輔助下，產(chǎn)生抗體，發(fā)揮體液免疫的作用，本組資料顯示重癥肺炎組CD4+T輔助性細(xì)胞明顯減少，顯然存在不能給B淋巴細(xì)胞提供足夠的輔助功能的可能性，再加上嬰幼兒免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完善，呼吸道局部免疫功能不足，肺泡巨噬細(xì)胞殺菌和吞噬能力低下，嬰幼兒呼吸道分泌的溶菌酶、乳鐵蛋白、補體、干擾素等與抵抗病原微生物的物質(zhì)含量低，且B淋巴細(xì)胞也未完全成熟，機體有時并不能產(chǎn)生特異性抗體[14]。所以雖然重癥肺炎組患兒B淋巴細(xì)胞比例上升，但生成抗體及發(fā)揮體液免疫功能并不一定增強。

NK細(xì)胞稱為自然殺傷細(xì)胞，是機體固有免疫的一部分，可直接殺傷病原體或被感染靶細(xì)胞，也可通過分泌γ干擾素(IFN-γ)來調(diào)節(jié)機體的免疫功能，促進Th1型免疫反應(yīng)[15]。本研究結(jié)果中重癥及非重癥肺炎組NK細(xì)胞水平較健康對照組均下降，但唯有重癥肺炎組與健康對照組NK細(xì)胞水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，這提示重癥肺炎患兒NK細(xì)胞免疫功能有受損更為嚴(yán)重的可能。

綜上所述，重癥肺炎及非重癥肺炎患兒的免疫功能都受到了不同程度損害。CD19+B細(xì)胞比例與疾病嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)的趨勢，而CD3+CD8+T細(xì)胞比例與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)趨勢，CD3+CD8+T、CD19+B淋巴細(xì)胞水平能否成為臨床判斷疾病嚴(yán)重程度參考指標(biāo)，尚有待進一步研究。同時，本次研究提示重癥肺炎患兒細(xì)胞免疫功能存在受損更為嚴(yán)重的可能性，其T細(xì)胞總數(shù)及各亞群水平均顯著下降，識別和殺傷致病菌能力被削弱，有利于致病菌進一步擴散繁衍而加重疾病進展，這提示在臨床治療方面，除了應(yīng)用相應(yīng)抗生素進行治療，也要注重的應(yīng)用免疫調(diào)節(jié)劑，可能對防止并發(fā)癥、提高療效、縮短病程有重要意義。同時我們也注意到本次研究存在樣本量較少和未能涉及CD19+B細(xì)胞亞群檢測的局限性，需要未來更多的研究去填補這一局限。

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[收稿2015-06-03修回2015-07-23]

(編輯張曉舟)

Analysis difference of lymphocyte subgroups between children with severe pneumonia and non-severe pneumonia

LONGSi-Qi,MALi,CHENMin,LIHong.

CentralLaboratory,AffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China

[Abstract]Objective:To observe the levels of lymphocyte subgroups in children with severe pneumonia and non-severe pneumonia,and to investigate the change of celluer immune funciton of patients,moreover provide available reference for treatment.Methods: Flow cytometry instrument was used to detect peripheral blood CD3+T,CD3+CD4+T,CD3+CD8+T,CD19+B lymphocytes and NK cells in 27 children with severe pneumonia and 28 children with non-severe pneumonia.In addition 20 heathy children were selected as the controls.Results: Compared with the heathy control group,the levels of CD3+T,CD3+CD4+T,CD3+CD8+T lymphocytes and NK cells in children with severe pneumonia decreased significantly(P<0.01,P<0.05,P<0.01,P<0.05),while CD4/CD8 ratio,CD19+B cells were significantly increased(P<0.05,P<0.01).The level of CD3+CD8+T lymphocytes in children with non-severe pneumonia significantly lower than the heathy control group(P<0.01),but the level of CD19+B cells in children with non-severe pneumonia significantly higher than the heathy control group(P<0.01).Compared with non-severe pneumonia group.The levels of CD3+and CD3+CD8+T lymphocytes in children with severe pneumonia decreased significantly(P<0.01),however CD19+B cells were significantly increased(P<0.01).Conclusion: Immune dysfunction exists in both of children with severe pneumonia and non-severe pneumonia.Children with severe pneumonia has more serious damage in inmmunity.This provides certain theoretical basis for clinical evaluation and treatment.

[Key words]Severe pneumonia；T lymphocytes subsets；CD19+B lymphocytes ；Cellur immunity

中圖分類號R563.1

文獻標(biāo)志碼A

文章編號1000-484X(2016)03-0401-04

作者簡介：龍思琪(1988年-)，女，在讀碩士，檢驗技師，主要從事兒童免疫功能缺陷及流式細(xì)胞術(shù)臨床應(yīng)用的研究，E-mail:longsiqi330@163.com。通訊作者及指導(dǎo)教師：馬莉(1962年-)，女，教授，主任技師，碩士生導(dǎo)師，主要從事兒童免疫功能缺陷及自身免疫性疾病的研究，E-mail:18608505639@163.com。

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.03.023

①本文為貴州省衛(wèi)生廳科學(xué)技術(shù)基金項目(No.gzwkj2013-1-016)。

②貴州省貴陽市兒童醫(yī)院，貴陽550004。