穩(wěn)定表達(dá)人IFITM3的A549細(xì)胞株建立及其對(duì)禽流感病毒感染的抑制作用①

姜穎越　杜壽文　曹婷婷　趙　飛　王茂鵬　譚　鵬　辛　舒　朱羿龍　李文杰　李艷茹　李太元　李　昌④　金寧一④

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院,延吉133002)

?

穩(wěn)定表達(dá)人IFITM3的A549細(xì)胞株建立及其對(duì)禽流感病毒感染的抑制作用①

姜穎越杜壽文②③曹婷婷③趙飛③王茂鵬③譚鵬③辛舒③朱羿龍③李文杰③李艷茹李太元李昌③④金寧一③④

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院,延吉133002)

[摘要]目的：為深入研究IFITM3抗禽流感病毒作用及其分子機(jī)制提供細(xì)胞模型，建立穩(wěn)定表達(dá)人IFITM3蛋白的A549細(xì)胞株。方法：首先合成引物，分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞，PCR擴(kuò)增IFITM3基因，進(jìn)行DNA測序分析。測序正確后，將其克隆至慢病毒表達(dá)載體pLV-Puro中構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pLV-IFITM3，轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，在確定IFITM3可表達(dá)后，利用嘌呤霉素加壓篩選穩(wěn)定表達(dá)IFITM3的細(xì)胞株，通過熒光定量PCR和Western blot方法對(duì)獲得的穩(wěn)定細(xì)胞株進(jìn)行鑒定，同時(shí)分析IFITM3蛋白在穩(wěn)定細(xì)胞株的分布及其對(duì)細(xì)胞活性的影響。最后，基于建立的穩(wěn)定細(xì)胞株，用H5N1亞型禽流感病毒作為病毒測試模型，對(duì)IFITM3的抗病毒活性進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)。結(jié)果：成功獲得人外周血單個(gè)核細(xì)胞源IFITM3基因，構(gòu)建了重組慢病毒表達(dá)質(zhì)粒，并通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染結(jié)合嘌呤霉素壓力篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)IFITM3的A549細(xì)胞，且IFITM3主要分布在膜組分上，并對(duì)細(xì)胞活性無顯著影響，同時(shí)IFITM3可抑制H5N1亞型禽流感病毒感染。結(jié)論：成功獲得穩(wěn)定表達(dá)IFITM3的A549細(xì)胞，證明了IFITM3可抑制H5N1亞型禽流感病毒感染，為進(jìn)一步深入探討IFITM3限制流感病毒感染的作用機(jī)制和分子機(jī)理提供了細(xì)胞模型和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白3;穩(wěn)定表達(dá);禽流感病毒;抑制作用

干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白(Interferon-inducible transmembrane proteins,IFITMs)是近年發(fā)現(xiàn)的一類限制病毒進(jìn)入的宿主限制因子，主要包括IFITM1、IFITM2和IFITM3[1]。另外，該類蛋白還包括IFITM5和IFITM10，但二者不具有抗病毒活性。自2009年Brass等報(bào)道IFITMs抑制甲型流感病毒(Influenza A virus,IAV)、西尼羅病毒(West Nile virus,WNV)和登革熱病毒(Dengue virus,DENV)復(fù)制的早期階段以來[2]，很多科研人員圍繞著該類蛋白的抗病毒譜、抗病毒機(jī)制和分子機(jī)制等進(jìn)行了大量的探索。該類蛋白分子在其他多種囊膜病毒感染過程中發(fā)揮抗病毒活性，包括嚴(yán)重影響公共衛(wèi)生安全的病毒如埃博拉病毒(Ebola virus,EBOV)、馬爾堡病毒(Marburg virus,MARV)、水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)、SARS冠狀病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARS-CoV)、MERS冠狀病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)、裂谷熱病毒(Rift valley fever virus,RVFV)、丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)、人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV-1)及呼吸道合胞體病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)等[3-11]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，IFITM3還可以抑制一種非囊膜病毒即呼腸孤病毒感染[12]。該類蛋白具有如此廣泛的抗病毒活性，其具體作用機(jī)制就此成為關(guān)注的焦點(diǎn)。

以甲型流感病毒為靶標(biāo)的大量研究證實(shí)，IFITM蛋白作用于病毒進(jìn)入階段，具體可能通過抑制病毒-細(xì)胞膜或內(nèi)體膜融合而抑制病毒進(jìn)入[13,14]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，IFITM3對(duì)多種亞型的甲型流感病毒如H1N1、H3N2、H7N9及H5N1為外膜的假型病毒的進(jìn)入具有抑制作用[4,15,16]，而且發(fā)現(xiàn)多種物種如禽、豬和蝙蝠來源的IFITM3均能限制流感病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞[17,18]。這些研究進(jìn)展的取得多數(shù)得益于穩(wěn)定表達(dá)該類蛋白的細(xì)胞株，因?yàn)橐恍┘?xì)胞如A549和MDCK轉(zhuǎn)染效率較低，蛋白表達(dá)量低，而且瞬時(shí)轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞的影響較大，無疑會(huì)影響試驗(yàn)的穩(wěn)定性和重復(fù)性，給數(shù)據(jù)分析帶來不便。為此，本研究通過慢病毒表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染結(jié)合嘌呤霉素篩選構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)IFITM3的A549細(xì)胞，進(jìn)而分析其蛋白表達(dá)和對(duì)細(xì)胞活性的影響，并以H5N1亞型禽流感病毒為病毒模型初步探索IFITM3的抗病毒活性，為深入研究IFITM3的抗病毒機(jī)制提供細(xì)胞模型。

1材料與方法

1.1主要試劑人肺癌細(xì)胞A549由本實(shí)驗(yàn)室保存；真核表達(dá)載體質(zhì)粒pLV-puro(北京英茂盛業(yè)公司)；Ex Taq DNA聚合酶、EcoRⅠ和BamHⅠ內(nèi)切酶及pMD18-T克隆載體(TaKaRa)；T4 DNA連接酶(NEB)；M- MLV反轉(zhuǎn)錄酶和GoTaq qPCR Master Mix(Promega)；UNIQ-10柱式總RNA提取試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)有限公司)；嘌呤霉素和Anti-Flag antibody(Sigma)；F12培養(yǎng)基(Hyclone)；X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent(Roche)；ECL免疫印跡化學(xué)發(fā)光溶液(Thermo)；Anti-IFITM3 antibody(Proteintech)；Anti-GAPDH antibody(碧云天公司)；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG或山羊抗鼠IgG(中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中人IFITM3(GenBank：JQ610621.1)基因序列，設(shè)計(jì)IFITM3基因擴(kuò)增引物，上游(Fp3)添加EcoRⅠ酶切位點(diǎn)(加粗)、kozak序列(斜體)及Flag標(biāo)簽序列(下劃線)，下游(Rp3)添加BamHⅠ酶切位點(diǎn)(加粗)。Fp3:5′-GAATTCGCCACCATGGATTACAAGGATGACGACGATAAGAATCACACTGTCCAAAC-3′；Rp3:5′-GGATCCCTATCCATAGGCCTGGAAGA-3′。同時(shí)設(shè)計(jì)IFITM3定量PCR引物(qFp3:5′-ATGTCGTCTGGTCCCTGTTC-3′;qRp3:5′-GTCATGAGGATGCCCAGAAT-3′)，及GAPDH定量引物(qFp:5′-ACCCACTCCTCCACCTTTGAC-3′;qRp:5′-TGTTGCTGTAGCCAAATTCGTT-3′)。引物均由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.2人外周血單核細(xì)胞分離及靶基因擴(kuò)增取健康人外周血，與等量的Hanks液混合，利用Ficoll-Paque密度梯度離心收獲單核細(xì)胞PBMCs。Trizol法提取RNA，利用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以此cDNA為模板擴(kuò)增IFITM3基因，并將其連接到pMD18T simple載體上記為pMD-IFITM3，轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)，在篩選壓力下挑取陽性菌落并提取質(zhì)粒，用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切鑒定，并送吉林庫美生物公司測序。

1.2.3重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建將測序正確的pMD-IFITM3用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分離，DNA凝膠回收試劑盒回收IFITM3目的片段，將回收的片段克隆到真核表達(dá)載體pLV-puro上記為pLV-IFITM3，經(jīng)轉(zhuǎn)化、挑取單克隆菌落、提取質(zhì)粒及酶切鑒定獲得重組表達(dá)質(zhì)粒，大量制備與純化，測定質(zhì)粒濃度及純度，分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4A549細(xì)胞對(duì)嘌呤霉素敏感性分析在用嘌呤霉素篩選細(xì)胞之前，首先分析細(xì)胞對(duì)嘌呤霉素的敏感性。即分別用終濃度為0.5、1、2、3、4、5、6 μg/ml嘌呤霉素處理A549細(xì)胞，處理后每天在顯微鏡下觀察并記錄不同濃度的嘌呤霉素處理下的細(xì)胞狀態(tài)，確定最佳的嘌呤霉素篩選濃度。

1.2.5轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選將生長狀態(tài)良好的A549細(xì)胞(3×105cells)接種至6孔細(xì)胞板中，次日待細(xì)胞長至單層細(xì)胞時(shí)，利用X-tremeGENE HP DNA轉(zhuǎn)染試劑(轉(zhuǎn)染試劑∶質(zhì)粒為 2∶1)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后6 h更換新鮮的完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2溫箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h時(shí)，收集部分細(xì)胞提取細(xì)胞蛋白，另一部分細(xì)胞中加入嘌呤霉素至終濃度為4 μg/ml，繼續(xù)培養(yǎng)直至在嘌呤霉素壓力下，無新的死亡細(xì)胞出現(xiàn)。收集穩(wěn)定細(xì)胞株，分別提取細(xì)胞蛋白和RNA，利用Western blot和定量PCR分析穩(wěn)定細(xì)胞株中IFITM3蛋白的表達(dá)情況。

1.2.6穩(wěn)定細(xì)胞株的細(xì)胞活性分析用MTS法分析獲得的穩(wěn)定細(xì)胞株A549-IFITM3和A549-Vector的細(xì)胞活性。將細(xì)胞(2×103cells/well)接種至96孔細(xì)胞板中，同時(shí)設(shè)A549正常細(xì)胞對(duì)照，且每種細(xì)胞設(shè)6個(gè)重復(fù)，置于37℃、5%CO2溫箱培養(yǎng)，分別在12、24、36和48 h進(jìn)行細(xì)胞活性檢測。

1.2.7細(xì)胞膜蛋白與漿蛋白的分離收集穩(wěn)定細(xì)胞株，參考“細(xì)胞膜蛋白與漿蛋白抽提試劑盒(碧云天)”操作說明分離細(xì)胞的膜蛋白和漿蛋白。細(xì)胞中加入膜蛋白抽提試劑A，置于液氮和室溫反復(fù)凍融3次裂解細(xì)胞，4℃低速離心收集上清，然后4℃，14 000 r/min離心40 min分別收集沉淀和上清，沉淀加入膜蛋白抽提試劑B提取膜蛋白，測定蛋白濃度，Western blot分析IFITM3蛋白在膜蛋白和漿蛋白中的分布。

1.2.8病毒感染分析將穩(wěn)定細(xì)胞株A549-IFITM3及其對(duì)照細(xì)胞(1×105cells/well)接種于12孔板中，置于溫箱培養(yǎng)，次日按1 MOI接種H5N1亞型禽流感病毒于細(xì)胞中，4℃吸附1 h，然后用冷PBS洗2次，迅速轉(zhuǎn)移至37℃溫箱，分別在吸附后0、2、6、12、24、36、48 h收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，用RT-qPCR方法分析細(xì)胞中病毒基因的相對(duì)量。

2結(jié)果

2.1IFITM3基因克隆及序列分析分離健康人外周血單核細(xì)胞PBMCs，提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以此為模板，擴(kuò)增人IFITM3基因。如圖1A所示，PCR擴(kuò)增獲得約420 bp的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致。目的片段DNA測序結(jié)果顯示，人PBMCs源IFITM3基因與GenBank登錄的序列完全一致。同時(shí)還將PBMCs源的IFITM3與其他細(xì)胞來源的基因進(jìn)行氨基酸比對(duì)，發(fā)現(xiàn)PBMCs源的IFITM3氨基酸序列與293T細(xì)胞源的完全一致，但與HeLa源的IFITM3存在1個(gè)氨基酸差異(71 aa，圖1B)。

2.2重組表達(dá)質(zhì)粒pLV-IFITM3的鑒定用EcoRⅠ和BamHⅠ將IFITM3基因片段從測序正確的pMD-IFITM3酶切回收，連接到pLV-Puro慢病毒表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化后挑單克隆菌落培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。結(jié)果顯示，EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切pLV-IFITM3質(zhì)粒獲得約420 bp的條帶(圖1C)，表明表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.3A549對(duì)嘌呤霉素的敏感性分析為了確定穩(wěn)定細(xì)胞株篩選過程中嘌呤霉素的最佳濃度，用不同濃度的嘌呤霉素處理A549，觀察并記錄細(xì)胞狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，終濃度為2 μg/ml嘌呤霉素處理后第1天細(xì)胞中有漂浮細(xì)胞出現(xiàn)，且隨嘌呤霉素濃度的增大，死亡細(xì)胞數(shù)增多；第2天，4 μg/ml嘌呤霉素處理的A549細(xì)胞絕大部分漂浮。因此選擇穩(wěn)定細(xì)胞株篩選時(shí)嘌呤霉素的終濃度為4 μg/ml。

2.4穩(wěn)定表達(dá)IFITM3細(xì)胞株的篩選與鑒定pLV-IFITM3轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞48 h時(shí)，胰酶消化，收集部分細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，用Flag抗體檢測IFITM3的表達(dá)。結(jié)果如圖2A所示，F(xiàn)lag抗體和IFITM3抗體均檢測到pLV-IFITM3轉(zhuǎn)染細(xì)胞中IFITM3的表達(dá)，而在空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞中存在IFITM3固有表達(dá)。其余細(xì)胞繼續(xù)傳代并加嘌呤霉素(終濃度為4 μg/ml)進(jìn)行篩選，直至沒有死亡細(xì)胞出現(xiàn)，收獲篩選獲得的細(xì)胞株，提取細(xì)胞總RNA和蛋白，利用RT-PCR和Western blot對(duì)獲得的穩(wěn)定細(xì)胞株進(jìn)行鑒定。結(jié)果如圖2B～D所示，相對(duì)于載體對(duì)照細(xì)胞，穩(wěn)定表達(dá)IFITM3的A549細(xì)胞中IFITM3基因呈高水平轉(zhuǎn)錄(約300 000倍)；而且用IFITM3抗體和Flag抗體均檢測到IFITM3在穩(wěn)定細(xì)胞株中的表達(dá)。

圖1　IFITM3基因的擴(kuò)增、序列分析和重組質(zhì)粒鑒定Fig.1　Amplification(A),sequence analysis(B)of IFITM3 and identification of its recombinant plasmid pLV-IFITM3(C)

2.5IFITM3在細(xì)胞中的定位分離篩選獲得的穩(wěn)定細(xì)胞株的膜蛋白和漿蛋白，并通過Western blot方法分析IFITM3蛋白表達(dá)定位。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在A549-IFITM3細(xì)胞的膜蛋白中檢測到IFITM3的表達(dá)，在

其漿蛋白和載體對(duì)照細(xì)胞的膜蛋白及漿蛋白中均未檢測到該蛋白的表達(dá)(圖3)，表明IFITM3表達(dá)定位在細(xì)胞膜組分上，與其他相關(guān)報(bào)道一致[19]。

2.6IFITM3對(duì)細(xì)胞活性的影響分析利用MTS法分析穩(wěn)定表達(dá)IFITM3的A549細(xì)胞及其載體對(duì)照細(xì)胞的細(xì)胞活性。結(jié)果如圖4所示，A549-IFITM3的細(xì)胞活性在傳代后12 h稍低于載體對(duì)照細(xì)胞，但培養(yǎng)24～48 h兩者的細(xì)胞活性沒有顯著差異。整體上，IFITM3表達(dá)沒有顯著影響A549的細(xì)胞活性。

圖2　穩(wěn)定表達(dá)IFITM的A549細(xì)胞株的鑒定Fig.2　Indentification of A549-IFITM3 cells

圖3　穩(wěn)定細(xì)胞株中IFITM3表達(dá)分布Fig.3　Expression distribution of IFITM3 in A549-IFITM3 cells

2.7IFITM3對(duì)H5N1亞型禽流感病毒的抑制作用基于篩選獲得的穩(wěn)定表達(dá)IFITM3的A549細(xì)胞株，利用熒光定量PCR方法檢測H5N1亞型禽流感病毒結(jié)構(gòu)蛋白M1(圖5A)和M2(圖5B)基因的變化，初步分析IFITM3對(duì)H5N1亞型禽流感病毒感染的影響。結(jié)果顯示，相對(duì)于載體對(duì)照細(xì)胞而言，IFITM3過表達(dá)細(xì)胞感染后兩個(gè)病毒基因的表達(dá)呈現(xiàn)明顯延后的趨勢(shì)，且在吸附后0 h時(shí)病毒基因的量較少，表明IFITM3能夠顯著抑制H5N1亞型禽流感病毒的感染，而且這種抑制作用可能發(fā)生在病毒的進(jìn)入過程，上述研究與前人報(bào)道一致[4]，表明本研究已成功建立穩(wěn)定表達(dá)IFITM3的A549細(xì)胞株，該細(xì)胞株可用于進(jìn)一步分析IFITM3限制病毒感染的機(jī)制研究。

圖4　穩(wěn)定細(xì)胞株的細(xì)胞活性分析Fig.4　Cell viability analysis of A549-IFITM3

圖5　IFITM3抑制H5N1禽流感病毒感染Fig.5　IFITM3 protein restricts H5N1 avian influenza virus infection in A549 cellsNote: *.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001.

3討論

Ⅰ型干擾素(Interferon)是機(jī)體發(fā)揮抗病毒天然免疫的主要細(xì)胞因子，其與細(xì)胞表面受體結(jié)合，激活JAK-STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘導(dǎo)大量的干擾素刺激基因(Interferon-stimulated genes,ISGs)表達(dá)，從而發(fā)揮抗病毒、抗腫瘤或免疫調(diào)節(jié)作用[20,21]。作為其中重要的一員，IFITM蛋白廣泛表達(dá)在多種組織和細(xì)胞，是一種宿主細(xì)胞內(nèi)源性限制因子，在宿主內(nèi)源性抗病毒免疫中發(fā)揮重要作用。早在1996年就有IFITMs蛋白抗VSV和HCV感染的研究線索[22]，但沒有引起科學(xué)家的特別關(guān)注，直至2009年報(bào)道證實(shí)IFITM蛋白抑制甲型流感病毒的進(jìn)入階段[2]，自此掀開了研究其抗病毒譜及其作用機(jī)制的熱潮，特別是IFITM3。目前已知IFITM3對(duì)很多囊膜病毒和一些非囊膜病毒具有抑制作用，涉及10個(gè)病毒科20多種病毒，其中不乏嚴(yán)重威脅人類生命健康的烈性病毒如EBOV、H7N9及SARS-CoV等[23]。

研究表明，IFITM3蛋白主要定位在內(nèi)體或溶酶體膜上，但在細(xì)胞質(zhì)膜表面也有表達(dá)，且主要以Ⅱ型跨膜結(jié)構(gòu)蛋白存在[19]。另外，IFITM3蛋白上一些位點(diǎn)的棕櫚酰化、泛素化及磷酸化調(diào)節(jié)該蛋白的表達(dá)、定位也與抗病毒活性有關(guān)[24,25]。近期，針對(duì)IFITM3抑制病毒進(jìn)入的作用機(jī)制，很多學(xué)者提出了多種設(shè)想。其一，IFITM3蛋白可能改變內(nèi)體溶酶體腔的特性，不利于病毒融合，這可以解釋該蛋白似乎在細(xì)胞質(zhì)膜上不抑制病毒進(jìn)入[23]；其二，IFITM3改變膜的特性來抑制融合微孔的形成和擴(kuò)張[23]，如內(nèi)體或溶酶體膜上膽固醇堆積[26]、膜曲率改變等。然而，另有報(bào)道質(zhì)疑IFITM3抑制病毒進(jìn)入與內(nèi)體膽固醇堆積的相關(guān)性。盡管在IFITM作用機(jī)制方面取得了很多進(jìn)展，但具體的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。

本研究從人外周血單個(gè)核細(xì)胞中擴(kuò)增IFITM3基因并構(gòu)建重組慢病毒表達(dá)質(zhì)粒。為了避免假型病毒感染對(duì)宿主細(xì)胞的影響，實(shí)驗(yàn)通過重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染結(jié)合嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)IFITM3的A549細(xì)胞，且穩(wěn)定細(xì)胞株中IFITM3在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平均獲得高效表達(dá)，并主要表達(dá)在細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)上。同時(shí)，穩(wěn)定表達(dá)IFITM3的A549細(xì)胞與載體對(duì)照細(xì)胞對(duì)細(xì)胞的活性沒有顯著差異，為下一步病毒感染評(píng)價(jià)奠定了基礎(chǔ)。進(jìn)而，以嚴(yán)重影響公共衛(wèi)生安全的H5N1亞型禽流感病毒為測試模型對(duì)所構(gòu)建的穩(wěn)定細(xì)胞株中IFITM3的抗病毒活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果表明該細(xì)胞能夠抑制病毒感染，從而為IFITM3抗病毒機(jī)制的深入探索及抗病毒藥物的研發(fā)提供了細(xì)胞模型和前提基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Siegrist F,Ebeling M,Certa U.The small interferon-induced transmembrane genes and proteins[J].J Interferon Cytokine Res,2011，31:183-197.

[2]Brass AL,Huang IC,Benita Y,etal.The IFITM proteins mediate cellular resistance to influenza A H1N1 virus,West Nile virus,and dengue virus[J].Cell,2009，139:1243-1254.

[3]Weidner JM,Jiang D,Pan XB,etal.Interferon-induced cell membrane proteins,IFITM3 and tetherin,inhibit vesicular stomatitis virus infection via distinct mechanisms[J].J Virol,2010，84:12646-12657.

[4]Huang IC,Bailey CC,Weyer JL,etal.Distinct patterns of IFITM-mediated restriction of filoviruses,SARS coronavirus,and influenza A virus[J].PLoS Pathog,2011，7:e1001258.

[5]Chan YK,Huang IC,Farzan M.IFITM proteins restrict antibody-dependent enhancement of dengue virus infection[J].PLoS One,2012，7:e34508.

[6]John SP,Chin CR,Perreira JM,etal.The CD225 domain of IFITM3 is required for both IFITM protein association and inhibition of influenza A virus and dengue virus replication[J].J Virol,2013，87:7837-7852.

[7]Mudhasani R,Tran JP,Retterer C,etal.IFITM-2 and IFITM-3 but not IFITM-1 restrict Rift Valley fever virus[J].J Virol,2013，87:8451-8464.

[8]Perreira JM,Chin CR,Feeley EM,etal.IFITMs restrict the replication of multiple pathogenic viruses[J].J Mol Biol,2013，425:4937-4955.

[9]Compton AA,Bruel T,Porrot F,etal.IFITM proteins incorporated into HIV-1 virions impair viral fusion and spread[J].Cell Host Microbe,2014，16:736-747.

[10]Wrensch F,Winkler M,Pohlmann S.IFITM proteins inhibit entry driven by the MERS-coronavirus spike protein:evidence for cholesterol-independent mechanisms[J].Viruses,2014，6:3683-3698.

[11]Wrensch F,Karsten CB,Gnirss K,etal.Interferon-induced transmembrane protein-mediated inhibition of host cell entry of ebolaviruses[J].J Infect Dis,2015，212(Suppl 2):S210-S218.

[12]Anafu AA,Bowen CH,Chin CR,etal.Interferon-inducible transmembrane protein 3(IFITM3)restricts reovirus cell entry[J].J Biol Chem,2013，288:17261-17271.

[13]Li K,Markosyan RM,Zheng YM,etal.IFITM proteins restrict viral membrane hemifusion[J].PLoS Pathog,2013，9:e1003124.

[14]Desai TM,Marin M,Chin CR,etal.IFITM3 restricts influenza A virus entry by blocking the formation of fusion pores following virus-endosome hemifusion[J].PLoS Pathog,2014，10:e1004048.

[15]Wang Z,Zhang A,Wan Y,etal.Early hypercytokinemia is associated with interferon-induced transmembrane protein-3 dysfunction and predictive of fatal H7N9 infection[J].Proc Natl Acad Sci USA,2014，111:769-774.

[16]Feeley EM,Sims JS,John SP,etal.IFITM3 inhibits influenza A virus infection by preventing cytosolic entry[J].PLoS Pathog,2011，7:e1002337.

[17]Smith SE,Gibson MS,Wash RS,etal.Chicken interferon-inducible transmembrane protein 3 restricts influenza viruses and lyssaviruses in vitro[J].J Virol,2013，87:12957-12966.

[18]Benfield CT,Smith SE,Wright E,etal.Bat and pig IFN-induced transmembrane protein 3 restrict cell entry by influenza virus and lyssaviruses[J].J Gen Virol,2015，96:991-1005.

[19]Bailey CC,Kondur HR,Huang IC,etal.Interferon-induced transmembrane protein 3 is a type II transmembrane protein[J].J Biol Chem,2013，288:32184-32193.

[20]Schoggins JW,Rice CM.Interferon-stimulated genes and their antiviral effector functions[J].Curr Opin Virol,2011，1:519-525.

[21]Schneider WM,Chevillotte MD,Rice CM.Interferon-stimulated genes:a complex web of host defenses[J].Annu Rev Immunol,2014，32:513-545.

[22]Alber D,Staeheli P.Partial inhibition of vesicular stomatitis virus by the interferon-induced human 9-27 protein[J].J Interferon Cytokine Res,1996，16:375-380.

[23]Bailey CC,Zhong G,Huang IC,etal.IFITM-family proteins:the cell′s first Line of antiviral defense[J].Annu Rev Virol,2014，1:261-283.

[24]Chesarino NM,McMichael TM,Hach JC,etal.Phosphorylation of the antiviral protein interferon-inducible transmembrane protein 3(IFITM3)dually regulates its endocytosis and ubiquitination[J].J Biol Chem,2014，289:11986-11992.

[25]Chesarino NM,McMichael TM,Yount JS.Regulation of the trafficking and antiviral activity of IFITM3 by post-translational modifications[J].Future Microbiol,2014，9:1151-1163.

[26]A mini-Bavil-Olyaee S,Choi YJ,Lee JH,etal.The antiviral effector IFITM3 disrupts intracellular cholesterol homeostasis to block viral entry[J].Cell Host Microbe,2013，13:452-464.

[收稿2015-11-19]

(編輯張曉舟)

Establishment of A549 cell stain stably expressing human IFITM3 and its inhibition to avian influenza virus infection

JIANGYing-Yue,DUShou-Wen,CAOTing-Ting,ZHAOFei,WANGMao-Peng,TANPeng,XINShu,ZHUYi-Long,LIWen-Jie,LIYan-Ru,LITai-Yuan,LIChang,JINNing-Yi.

CollegeofAgriculture,YanbianUniversity,Yanji133002,China

[Abstract]Objective:To establish human lung carcinoma A549 cell stain stably expressing human interferon-inducible transmembrane protein 3(IFITM3)and provide a cell model for the research of the antiviral effect of IFITM3 and its molecular mechanism.Methods: Full-length IFITM3 gene was amplified from the cDNA of human peripheral blood mononuclear cells isolated previously,and cloned into a lentivirus expression vector pLV-Puro resulting into pLV-IFITM3 after DNA sequencing.IFITM3 was transfected into A549 cells to screen the cell stain stably expressing IFITM3(A549-IFITM3)with puromycin.The expression and distribution of IFITM3 and cell viability were detected and by quantitative PCR,Western blot and MTS assay respectively.Then the inhibitory effect of IFITM3 protein was preliminarily evaluated with H5N1 avian influenza virus as the virus model.Results: The A549 cell stain stably expressing IFITM3 was obtained by plasmid transfection and puromycin screening,and IFITM3 mainly distributed in the membrane fraction in the cell strain and had no significant effect on cell viability,and displayed strong restriction effect on H5N1 infection.Conclusion: A549 cells stably expressing IFITM3 were established and IFITM3 restricted avian influenza virus infection,providing the cell model and experimental basis to further explore its antiviral role and the molecular mechanism.

[Key words]Interferon-inducible transmembrane protein 3;Stable expression;Avian influenza virus;Restriction

中圖分類號(hào)S855.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000-484X(2016)03-0372-06

通訊作者及指導(dǎo)教師：李昌(1978年-)，男，副研究員，碩士生導(dǎo)師，主要從事分子病毒學(xué)與免疫學(xué)方面的研究，E-mail：lichang78@163.com。

作者簡介：姜穎越(1990年-)，女，在讀碩士，主要從事病毒感染與免疫學(xué)研究，E-mail：jessicajiang4521@163.com。

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.03.017

·免疫學(xué)技術(shù)與方法·

①本文為國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31472197)、吉林省青年科研基金項(xiàng)目(20140520173JH)和病原微生物生物安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(SKLPBS1435)資助。

②共同第一作者。

③吉林省人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所, 長春130122。

④江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州225009。

金寧一(1956年-)，男，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事分子病毒學(xué)與免疫學(xué)方面的研究，E-mail：ningyik@126.com。