T細胞疫苗抑制了Flt3-L介導的小鼠肝移植急性排斥反應①

趙振林　趙晨野　謝燕兵　楊　波　蘇繼榮

(山西醫科大學第二醫院普外科,太原030001)

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T細胞疫苗抑制了Flt3-L介導的小鼠肝移植急性排斥反應①

趙振林趙晨野②謝燕兵楊波蘇繼榮

(山西醫科大學第二醫院普外科,太原030001)

[摘要]目的：探討供體抗原特異性T細胞疫苗誘導肝移植免疫耐受的作用及其機理，同時對肝移植“自動耐受”機制進行探討。方法：以CBA小鼠作為受體，以B6小鼠作為供體，建立小鼠原位肝移植模型；制備T細胞疫苗：用B6小鼠的脾細胞免疫CBA小鼠，取CBA小鼠的脾淋巴細胞加以滅活，制備成T細胞疫苗(TCV)備用；實驗分為3組：組1:單純移植組，以CBA小鼠作為受體，以B6小鼠作為供體，做原位肝移植。組2:用Flt3-L治療的B6小鼠作為供體，以CBA小鼠作為受體，做原位肝移植。組3:用Flt3-L治療的B6小鼠作為供體，以TCV免疫過的CBA小鼠作為受體，進行原位肝移植。組間比較移植物存活時間(MST)；測定肝移植小鼠血清中的IL-10、IL-4和IFN-γ水平；組內比較移植前后單向混合淋巴細胞反應(MLR)；分離移植物浸潤細胞(GICs)組間比較GICs凋亡率。結果：Flt3-L誘導了同種移植急性排斥反應，應用TCV于移植前和移植后可以顯著抑制Flt3-L誘導的同種肝移植排斥反應。在沒有Flt3-L刺激作用的情況下移植排斥反應非常輕微。肝移植小鼠血清中的IL-10、IL-4和IFN-γ水平檢測發現，Flt3-L治療組IFN-γ水平顯著升高，IL-10、IL-4水平降低；TCV免疫組IL-10、IL-4水平顯著升高，IFN-γ水平顯著下降；單純移植自動耐受組與TCV免疫組變化趨勢一致。單向混合淋巴細胞反應(MLR)顯示：在單純移植組，淋巴細胞增殖效應不明顯，CPM為3 318±1 190；在Flt3-L治療組，效應細胞增殖顯著增強,CPM 為9 790±1 369，在TCV免疫組，TCV免疫加Flt3-L治療，淋巴細胞增殖效應被顯著抑制，CPM為4 017±880。分離肝臟移植物內浸潤細胞凋亡，TCV免疫組引起TIL凋亡率為(54.20±3.12)%，有效抑制了TIL引起的免疫排斥反應，誘導了免疫耐受。而在Flt3-L治療組，TIL凋亡率為(3.34±2.49)%。結論：小鼠同種肝移植存在“自動耐受”現象；這種“自動耐受”現象的免疫平衡可以被Flt3-L打破，從而誘發急性排斥反應。針對排斥效應T細胞的特異性T細胞疫苗可以顯著抑制Flt3-L誘導的同種肝移植排斥反應。

[關鍵詞]T細胞疫苗； 同種移植；免疫耐受；肝移植

針對移植供體的特異性T淋巴細胞是同種移植免疫排斥的效應細胞，如果能將這些效應細胞清除或有效抑制，則可以防止免疫排斥的發生。本文作者長期致力于T細胞疫苗誘導移植免疫耐受的研究[1]，其基本策略是用供體器官抗原刺激受體誘導體產生排斥性T細胞，再將這些T細胞分離滅活，制備成T細胞疫苗，在移植前和移植后用TCV 免疫受體動物，誘導產生針對排斥效應T細胞的免疫反應，從而達到抑制或清除反應性T淋巴細胞,誘導特異性移植耐受的作用[2,3]。因為小鼠肝移植具有自動接受現象，本研究選擇小鼠原位肝移植模型，對研究移植免疫耐受具有重要價值。本研究設計旨在比較同種肝移植在發生急性排斥反應、發生自動耐受、應用T細胞疫苗誘導免疫耐受三種狀態下的免疫機制，進一步探討T細胞疫苗誘導同種移植免疫耐受的方法和機制。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物以CBA小鼠作為受體，以B6小鼠作為供體，建立小鼠原位肝移植模型清潔級,以上動物由山西醫科大學實驗動物中心提供。

1.1.2試劑及藥品Flt3-L(PeproTech EC Ltd.)；Annexin V-FITC(BD Biosciences)； Con A、淋巴細胞分離液、RPMI1640細胞培養液胎牛血清(華美公司)；絲裂霉素(Kyowa hakko co Ltd.)；3H-TDR(北京原子能研究所)。

1.2方法

1.2.1T細胞疫苗制備(TCV)制備B6小鼠的肝細胞懸液，按照1×106/次腹腔注射，連續3次，每周1次，于第3次免疫后第5天，分別取出被免疫的CBA小鼠的脾臟，用密度梯度離心法分離脾淋巴細胞，用RPMI1640完全培養液調整細胞濃度至2×105ml-1，加Con A 2.5 μg/ml,混合后移至100 ml的培養瓶內(10 ml/瓶)，置5%CO237℃孵箱中培養48 h后收集細胞，然后加入絲裂霉素C(25 μg/ml)處理滅活細胞(37℃水浴45 min)，用RPMI1640培養液調整細胞濃度到1×108ml-1，制成供體特異性T淋巴細胞疫苗(TCV)凍存備用 。

1.2.2Flt3-L治療B6小鼠于移植前3周給B6小鼠皮下注射Flt3-L,1 mg/kg,每周1次，連續3周。

1.2.3實驗分組及原位肝移植，統計移植物平均存活時間 (Mean survival time,MST)組1:單純移植組，以CBA小鼠作為受體，以B6小鼠作為供體，做原位肝移植。組2:用Flt3-L治療的B6小鼠作為供體，以CBA小鼠作為受體，做原位肝移植。組3:用Flt3-L治療的B6小鼠作為供體，以TCV免疫過的CBA小鼠作為受體，進行原位肝移植。

肝移植手術屬于清潔型手術，乙醚麻醉，應用三袖套法進行小鼠原位肝移植,參見文獻[4]。術后肌注青霉素40萬U，3 d內單籠喂養。實驗小鼠肝移植無肝期要求無肝期小于20 min,手術順利，術后正常蘇醒，能活動，非排斥性原因致死者除外。

1.2.4單向混合淋巴細胞反應(MCR)(3H-TDR摻入法)移植后第5天進行單向混合淋巴細胞反應(MLR)，反應細胞為經TCV 免疫后的CBA小鼠的脾T淋巴細胞，刺激細胞為滅活的B6小鼠脾T淋巴細胞，兩者濃度均為1×106ml-1，取96孔細胞培養板，每孔加入反應細胞100 μl，刺激細胞100 μl，每份標本設三復孔，在含體積分數為5%CO237℃ 飽和濕度下培養96 h，終止培養前18 h每孔加入1 μg3H-TDR。培養結束后，收集細胞于玻璃纖維濾紙上，用蒸餾水反復沖洗，將樣品濾紙置于60℃～80℃的烤箱內烘干，將紙片分別置于閃爍瓶中，每瓶加閃爍液5 ml，用液體閃爍計數器測定每分鐘脈沖數值(cpm值) 。

1.2.5肝臟移植物內浸潤細胞分離和GICs凋亡測定于移植后3 d取肝臟移植物應用原位灌注及膠原酶消化法[3]分離肝臟NPC(Nonparenchymal cells)，用0.09%EGTA液經門-腔靜脈原位灌注后再用0.05%、含Ca+的Ⅵ型膠原酶灌注,無菌取下肝臟,剪碎后,用Ⅵ型膠原酶消化,用200目鋼絲網過濾,制備成細胞懸液,用RPMI1640培養液洗滌兩次,用Percoll液(比1.079,Sigma公司)分離,收集中層細胞，臺盼藍拒染法鑒定活細胞>95%。取肝臟NPC用PBS液洗滌兩次,用陽性磁珠分離法分離CD3陽性T細胞，調整細胞濃度為1×106ml-1，進行流式細胞檢測，取每一管標本100 μl細胞,加AnnexinV-FITC 5 μl和 PI 5 μl，常溫避光孵育15 min后，加400 μl結合液，用FACSCalibur流式細胞儀(美國Becion Dickinson)分析。

2結果

2.1各組肝移植后大鼠存活時間(MST)在移植對照組，MST為(41.9±3.0)d；在Flt3-L治療組，MST為(6.7±2.4)d；而在Flt3-L加TCV組MST為(80.7±10.2)d，移植物存活時間顯著延長，與Flt3-L治療組比較P<0.01，見圖1。

2.2移植小鼠血清中的IL-10、IL-4和IFN-γ水平測定測定肝移植小鼠血清中的IL-10、IL-4和IFN-γ水平，并設正常對照。Flt3-L治療組IFN-γ水平顯著升高，IL-10、IL-4水平降低；TCV免疫組IL-10、IL-4水平顯著升高，IFN-γ水平顯著下降；單純移植自動耐受組與TCV免疫組趨勢一致。見圖2。

2.3單向混合淋巴細胞反應(MLR)結果于移植后第3天進行單向混合淋巴細胞反應,應用3H-TDR摻入法,最后用液體閃爍計數器測得每分鐘脈沖數值(cpm值)。在單純移植組，淋巴細胞增殖效應不明顯，為3 318±1 190；在Flt3-L治療組，效應細胞增殖顯著增強到9 790±1 369;Flt3-L +TCV組，淋巴細胞增殖效應被顯著抑制， cpm為4 017±880,與單純移植物比較無顯著差異，和Flt3-L治療組比較顯著降低(P<0.01)，見圖3。

圖1　各組肝移植后大鼠存活時間(MST)Fig.1　Mean survival time (MST) after liver transplanta-tion in three groupNote: TCV vaccination significantly prolonged the grafts mean survival time (MST) in TCV group , but Flt3-L mediated acute immune rejection against the liver grafts which result in shortened MST compared with the TCV group and transplant control.

2.4肝臟移植物內浸潤細胞凋亡流式細胞檢測結果流式細胞儀檢測肝臟移植物內浸潤T細胞凋亡情況：TCV免疫組引起GICs凋亡率為(54.20±3.12)%，顯著有效抑制了GICs引起的免疫排斥反應，誘導了免疫耐受。而在Flt3-L治療組，GICs凋亡率為(3.34±2.49)%。見圖4，表1。

圖2　肝移植小鼠血清中的IL-10、IL-4和IFN-γ水平測定Fig.2　Serum value of IL-10,IL-4 and IFN-γ after liver transplantationNote: TCV induced incresed production of IL-4 and IL-10 but depressed the production of IFN-γ in TCV group; Flt3-L mediated acute rejection with incresed IFN-γ and reduced IL-4 and IL-10.

圖3　單向混合淋巴細胞反應(MLR)Fig.3　Cpm value of one-way mixed lymphocyte reaction in three groups after transplantation(MLR)Note: The TCV depressed the responding T cells proliferation which may contribute to the inducing immune tolerance .Flt3-L stimulated the proliferation of responding T cells.

表1肝臟移植物浸潤細胞凋亡

Tab.1Apoptosis rate of liver graft infiltrating cells

GroupsGroups1Groups2Groups3Apoptosis(%)7.92±2.253.34±2.491)54.20±3.121)

Note：1)P<0.01 versus group 1.

圖4　肝臟移植物內浸潤細胞凋亡Fig.4　Apoptosis of liver graft infiltrating cells:TCV induced incresed apoptosis of GICs in TCV group，The percentage of apoptosis of GICs was markedly increased in Flt3-L+TCV group in comparison with Flt3-L group.

3討論

器官移植后發生急慢性免疫排斥仍然是器官移植面臨的主要難題，盡管目前應用免疫抑制劑可以有效抑制急性免疫排斥反應，但免疫抑制劑帶來的毒副作用嚴重影響了患者的重要臟器功能和患者的生存質量[5]，因此探討誘導特異性移植免疫耐受是目前移植免疫研究的核心問題。研究小鼠肝移植自動耐受現象的機理對探討誘導同種免疫耐受方法具有重要價值，本研究以小鼠原位肝移植作為研究模型，發現小鼠同種肝移植存在自動耐受現象，在沒有任何免疫干預的情況下可以不發生排斥反應，同時移植物內無明顯炎性浸潤細胞。本實驗用Flt3-L刺激B6小鼠介導了同種肝移植急性排斥反應，在實驗組用T細胞疫苗于移植前后免疫CBA大鼠，再用Flt3-L刺激B6小鼠的肝臟進行移植，則不能誘導發生急性免疫排斥反應。

研究表明肝移植“自動耐受”與外周T細胞凋亡有關,肝臟含有大量的過客細胞,其中不成熟樹突狀細胞(Dendritic cells,DCs)比例很高,這些不成熟的DCs細胞低表達MHC，不表達B7分子，這些DC細胞(immature DCs)雖然有攝取處理抗原和一定的抗原呈遞能力，但不能活化T細胞，反而導致T細胞無能。因此導致肝臟不發生免疫排斥，出現所謂的“自動耐受”現象。因此肝臟被稱為“耐受器官”、“優惠器官(Privileged organ)”。Thomson 等[6]從小鼠肝臟中分離出DCs前體細胞(DCs progenitors),在體外加入GM-CSF及IL-4擴增后,于小鼠心臟移植前輸入受體小鼠,發現移植的異體心臟存活期明顯延長,證明了不成熟的DCs具有誘導耐受的功能。

Flt3-L是如何誘發同種肝移植急性排斥反應的？其機理與DC分化有關[7]，研究發現Flt3-L能夠誘導供體間質樹突狀細胞(Interstitial DCs)的增加,這些間質DCs分化為成熟的DCs遷移到肝臟,從而誘發了肝移植急性排斥反應的發生。

在研究中,于移植前后用T細胞疫苗免疫CBA受體小鼠,發現Flt3-L介導的急性排斥反應被TCV抑制,TCV免疫使移植物存活期顯著延長，T細胞凋亡顯著增加；以接受TCV的CBA的T細胞作為反應細胞，以接受Flt3-L治療的B6小鼠脾細胞作為刺激細胞作單向混合淋巴細胞反應，T細胞增殖被顯著抑制，而以未治療的CBA的T細胞作為反應細胞，以接受Flt3-L治療的B6小鼠脾細胞作為刺激細胞作單向混合淋巴細胞反應，T細胞增殖顯著增強。而在單純移植出現自動耐受的情況下，雖然沒有發生急性排斥反應，但是其T細胞凋亡無顯著增加。由此可以推斷，肝移植自動耐受是由于肝臟組織內不成熟的DC細胞誘導了T細胞的活化障礙和向調節性T細胞轉化，因此導致了移植物無反應狀態。用Flt3-L治療供體小鼠，可以顯著增加間質DC向成熟DC轉化，促使成熟DC向肝臟募集，當肝移植后存在于肝臟中的大量成熟DC細胞就會活化大量的反應性T淋巴細胞，從而誘發急性免疫排斥反應[8,9]。TCV疫苗細胞是用供體肝臟抗原刺激受體產生的移植排斥效應T細胞經滅活而得，用TCV免疫受體就會誘導產生針對移植排斥效應T細胞的獨特型T細胞克隆，獨特型T細胞克隆針對移植排斥效應T細胞的免疫反應清除了移植排斥效應細胞，抑制了肝移植免疫排斥反應的發生[10]。

TCV誘導免疫耐受與T細胞克隆轉換有關[11,12]，CD4+和CD8+T細胞通過識別自身TCR的抗原決定簇而發揮作用，本研究發現TCV 誘導了CD4/CD8降低，CD8T細胞比例上升，說明CD8+T細胞在TCV誘導移植耐受中起著重要作用。T細胞疫苗誘導并激活了CD8+抗獨特型T細胞，通過CD8+抗獨特型T細胞的作用誘導針對供肝抗原的反應性T細胞凋亡。

本研究發現TCV疫苗導致移植肝內IL-4 mRNA的表達顯著上調，INF-γ mRNA的表達受到明顯抑制。說明T細胞疫苗可以誘導Th前體向Th2分化。 致敏的CD4+T細胞與抗原接觸后，分化成Th1和Th2，Th1主要分泌IL-2和IFN-γ，Th2主要分泌IL-4、IL-5和IL-10等，肝移植自動耐受時，供肝內含有大量的缺乏共刺激分子活性的DCs前體，阻礙了CD4+反應性T細胞進一步活化,使Th前體分化為Th2，形成了有利于肝移植“自動耐受”的環境[13]。而Flt3-L誘導的成熟DCs增加，這些DC細胞具有充足的共刺激分子活性，使肝移植后CD4+反應性T細胞進一步活化,Th前體分化為Th1，介導了強烈的免疫排斥反應。根據本研究，T細胞疫苗可以誘導針對反應性T細胞的CD8+抗克隆型T細胞產生，這些CD8+調節性T細胞可以從另一個水平對Th1和Th2進行調控，從Th2中識別出成熟的Th1并加以抑制或清除[14]。所以TCV誘導移植耐受存在多環節多水平。

T細胞疫苗是作者的系列研究，本實驗研究通過B6小鼠作為供體，CBA小鼠作為受體的原位肝移植模型證明：肝移植存在“自動耐受”現象,其機理與肝臟內的幼稚DC無法遞呈抗原有關，而Flt3-L可以增加肝移植物內的成熟DC細胞，通過mDC活化反應性CTL細胞，促進Th0向Th1轉化，誘導急性排斥反應的發生；TCV 可以誘導針對供肝抗原免疫排斥效應細胞的抗獨特性克隆的CD8獨特型克隆T細胞，這一群獨特克隆T細胞清除了移植排斥效應細胞，抑制了免疫排斥反應，同時TCV還可以促進Th0向Th2轉化，為移植免疫耐受創造有利條件。證明了T細胞疫苗能夠有效地抑制肝移植急性排斥反應,具有誘導特異性移植耐受的作用。

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[收稿2015-08-03修回2015-09-15]

(編輯倪鵬)

Effects of donor-Ag specific T cell vaccination on inhibiting Flt3-L-induced acute liver allograft rejection

ZHAOZhen-Lin,ZHAOChen-Ye,XIEYan-Bing，YANGBo，SUJi-Rong.

DepartmentofHepatobiliarySurgery,theSecondHospital,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China

[Abstract]Objective:To investigate the effect and mechanism of donor-Ag specific T cell vaccination on inducing specific immune tolerance of allogenic liver transplantation and the mechanism of immune privilege of liver transplantation.Methods: CBA mice were recipients,B6 mice were donors,T cell vaccination (TCV) were made from the attenuated spleen cells of CBA mice,which were stimulated by Con A and were challenged with the spleen cells of B6 mice.There are 3 groups in this experiment:Transplant control group:Orthotopic liver transplantation (OLT) were performed with the recipients of CBA mice and donors of B6 mice;Flt3-L treating group:OLT were performed with the recipients of CBA mice and donors of B6 mice treated with Flt3-L;TCV group:OLT were performed with the recipients of CBA mice inoculated with TCV and donors of B6 mice treated with Flt3-L.Median survival time (MST) of liver grafts was recorded,IL-4,IL-10 and IFN-γ in peripheral blood were tested after transplantation in each group.One-way mixed lymphocyte reaction(MLR) were carried out with effectors of spleen cells from CBA mice and stimulator of spleen cells from B6 mice at the 5th day after transplantation.The apoptosis of liver graft infiltrating cells (GICs) were analyzed by flow cytometric analysis at the 5th day after transplantation.Results: Flt3-L treating donor activated allogenic acute rejecting reaction,TCV vaccinating recipient before and after transplantation significantly depressed the acute immune rejecting reaction mediated by Flt3-L.The liver grafts were accepted by recipient without the presence of Flt3-L.The cytokines test show that the serum value of IL-4 and IL-10 were increased in Transplant control group and TCV group,but decreased in Flt3-L treating group.The value of IFN-γ was increased in Flt3-L treating group,but decreased in Transplant control group and TCV group .The result of one-way MLR show that the cpm values in Flt3-L treating group was 9 790±1 369 which was higher than Transplant control group which was 3 318±1 190;the cpm values in TCV group was 3 318±1 190 which show that TCV inhibited Flt3-L mediated liver transplant acute immune rejection.The flow cytometric analysis showed that the percentage of apoptosis of TILs was markedly increased in TCV group (54.20±3.12) in comparison with Flt3-L treating group(3.34±2.49%).The apoptosis analysis certified that TCV inhibited the TIL-mediated immune rejecting reaction.Conclusion: Automatic tolerance can be observed at the situation of allogenic liver transplantation in mice,Flt3-L can break the balance of automatic tolerance and mediate acute rejection reaction .Donor-Ag specific T cell vaccination can successfully inhibit acute immune rejection mediated by Flt3-L.

[Key words]T cell vaccine;Allogenic;Immune tolerance;Liver transplantation

中圖分類號R392.4

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)03-0327-05

作者簡介：趙振林(1967年-)，男，博士，教授，主任醫師，主要從事移植免疫方面的研究，E-mail:2412205354@qq.com。

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.03.007

①本文受山西省歸國留學人員科研基金資助(No.2010-57)。

②深圳大學第一附屬醫院干細胞再生醫學科，深圳518035。