促吞噬肽(Tuftsin)在實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠中的神經功能改善作用①

賈　娜　武俏麗　紀　勇　徐小林

(天津醫科大學，天津300070)

?

促吞噬肽(Tuftsin)在實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠中的神經功能改善作用①

賈娜武俏麗②紀勇②徐小林②

(天津醫科大學，天津300070)

[摘要]目的：探索促吞噬肽(Tuftsin)在實驗性自身免疫性腦脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)小鼠模型中的神經功能改善作用。方法：用髓鞘少突膠質細胞糖蛋白35-55(MOG35-55)免疫C57BL/6小鼠，應用微量注射泵皮下緩慢注射500 μmol/L Tuftsin。每天對各組小鼠進行神經功能評分，免疫后28 d處死各組小鼠并取其腦和脊髓組織，觀察并比較各組炎性細胞浸潤部位及程度、有無脫髓鞘及脫失程度，以及比較各組 IL-10和TNF-α的表達情況。結果：①Tuftsin干預組小鼠發病率比EAE模型組低，平均神經功能評分小于EAE模型組(P<0.05)。②Tuftsin干預組較EAE模型組炎性細胞的浸潤程度和髓鞘的脫失程度及范圍減輕(P<0.05)。③Tuftsin干預組的IL-10的表達量比EAE模型組高(P<0.05)，TNF-α的表達比EAE模型組低。結論：Tuftsin通過降低炎性反應、增強抗炎作用在中樞神經系統中發揮保護功能，降低EAE模型小鼠的炎性細胞浸潤及脫髓鞘程度，減緩EAE小鼠的癥狀、促進其神經功能的恢復。

[關鍵詞]多發性硬化;實驗性自身免疫性腦脊髓炎;促吞噬肽

多發性硬化(Multiple sclerosis,MS)是中樞神經系統(Central nervous system,CNS)最常見的慢性炎癥性脫髓鞘疾病，由于免疫系統攻擊髓鞘導致軸索及神經元的退行性病變。其病理特征是血管周圍炎性病變、髓鞘破壞、星型細胞增殖、少突膠質細胞和軸索缺失。目前多發性硬化的機制尚未完全明了，在一項關于EAE和MS最新研究動向的綜述中提出，EAE是由Th1細胞免疫介導的器官特異性自身免疫病。實驗性自身免疫性腦脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)是由CD4+T 淋巴細胞介導，導致中樞神經系統白質脫髓鞘改變的自身免疫性疾病，是MS的理想動物模型[1]。

Tuftsin[2]是一種天然的促吞噬肽，由蘇-賴-脯-精(Thr-Lys-Pro-Arg)四種氨基酸組成。1970年Najjar和Nishioka[2]首次描述了其特點，Tuftsin能夠促進單核細胞來源的細胞的吞噬活性，如中性粒細胞、巨噬細胞、小膠質細胞等，作用機制與這些細胞表面存在Tuftsin受體有關，同時Tuftsin還具有抗炎、抗腫瘤等作用[3-5]。國外有實驗證明，Tuftsin及其類似物可以通過化學合成的方法獲得，并廣泛的應用于臨床研究[6]。既往有研究通過體內及體外實驗得出Tuftsin可以促進T淋巴細胞的活性。而T淋巴細胞介導的免疫反應在過去被認為在EAE小鼠神經元和軸索退行性病變的過程中起到關鍵作用[7]。

因此研究Tuftsin在EAE小鼠中可能發揮的作用可以為MS的臨床實驗研究提供一種新的治療靶點及策略。國外有少量該方面的報道，證實Tuftsin通過改變T淋巴細胞或單核細胞的免疫表型，從而對中樞神經系統發揮保護作用。但是具體的機制目前還未完全明確，且目前國內尚未有相關的研究。本研究通過微量注射泵將Tuftsin緩慢注射于EAE小鼠皮下，著重觀察及比較其與EAE模型組的臨床神經功能評分及組織病理染色結果。

1材料與方法

1.1材料8～10周，體重約20 g的雌性C57BL/6小鼠共30只，購自北京華阜康生物技術有限公司。30只C57BL/6小鼠共分為3組，即正常對照組、EAE模型組、Tuftsin干預組。鼠源MOG35-55多肽及Tuftsin由南京金斯瑞基因技術公司合成，純度≥98%。弗氏完全佐劑(CFA)購自美國Sigma公司；滅活結核菌素桿菌(TB)購自美國Difco公司；百日咳毒素(PTX)購自美國List Biological Laboratories公司。提取總RNA試劑盒購自美國OMEGA公司，反轉錄試劑盒購自Invitrogen公司，RT-PCR試劑盒購自美國Roche公司。

1.2方法

1.2.1EAE模型的建立及分組EAE組以200 μg MOG35-55溶入200 μl PBS緩沖液，再與200 μl CFA充分混合成乳劑(滅活結核菌素桿菌終濃度為5 mg/ml)，正常對照組則直接將200 μl PBS與200 μl CFA充分混合。200 μg乳劑于小鼠背部分兩點皮下注射。分別于免疫后0 h及48 h腹腔注射500 ng PTX。 EAE模型建立后第1天用微量注射泵將500 μmol/L Tuftsin 20 μl緩慢注射于小鼠背部皮下，連續10 d，共200 μl[8]，制成Tuftsin干預組。

1.2.2各組實驗小鼠神經功能評分免疫后每天對各組實驗小鼠進行神經功能評分，連續觀察28 d。神經功能評分按以下標準進行[9]：0分為無癥狀；1分為尾巴張力下降(完全無力，尾巴尖端不能卷曲)或后肢無力(步態不穩)；2分為尾部和后肢無力；3分為后肢癱瘓(單側或雙側后肢一定程度上可以運動)；4分為后肢完全癱瘓(后肢完全不能運動或前肢拖動后肢運動)；5分為死亡。

1.2.3組織病理學觀察各組取4只實驗組小鼠在免疫后第28天采用心臟灌注法處死，4%多聚甲醛灌注后，快速取出脊髓組織，放入4%多聚甲醛中固定。脊髓組織用石蠟包埋連續切片，切片厚度為5 μm，脊髓頸及腰段取橫切面分別進行蘇木素-伊紅染色、快藍染色，在光學顯微鏡下觀察脊髓組織的形態、炎性細胞浸潤部位及程度、髓鞘脫失的情況。

1.2.4實時定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)應用RT-PCR法定量測定各組小鼠腦組織內IL-10 及TNF-α的表達情況。各組取6只實驗小鼠在免疫后第28天分別處死，迅速取出各組腦組織放入液氮中滅活RNA酶。采用OMAGA總RNA提取試劑盒按說明書操作從各組腦組織中提取總RNA；采用Invitrogen反轉錄試劑盒按說明書操作將其逆轉錄為cDNA。使用Roche的定量試劑盒進行定量檢測。定量過程中條件為：95℃反應5 min；變性、擴增和延伸分別為95℃反應 20 s，62℃(IL-10)或60℃(TNF-α)反應20 s，72℃反應20 s，共50個循環。72℃反應5 min。使用GAPDH作為內參校正。所用引物為：GAPDH、TNF-α、IL-10，均為小鼠來源。引物序列為：GAPDH:Forward：5′-TTCACCACCATGGAGAAGGC-3′，Reverse：5′-GGCATGGACTGTGGT-CATGA-3′；TNF-α：Forward：5′-CATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAA-3′，Reverse：5′-TGGGAGTAGACAAGGTACAACCC-3′；IL-10：Forward：5′-TGGCCACACTTGAGAGCTGC-3′，Reverse：5′-TTCAGGGATGAAGCGGCTGG-3′。

2結果

2.1發病情況通過觀察發現：正常對照組的實驗小鼠均未發病，EAE模型組發病率為100%，Tuftsin干預組發病率為60%，各組死亡率均為0%，采用Fisher精確檢驗比較三組發病率，正常對照組與EAE模型組及Tuftsin干預組比較均有顯著差異，差異具有顯著統計學意義(P<0.05)；EAE模型組發病率與Tuftsin干預組相比差異具有統計學意義(P<0.05)。統計兩組發病小鼠的起病時間：EAE模型組平均起病時間為(17.5±1.67)d，Tuftsin干預組小鼠為(14.6±1.29)d，兩組比較差異有顯著統計學意義(P<0.05)。比較兩組發病小鼠的平均神經功能評分，EAE模型組發病小鼠的平均神經功能評分為(2.00±0.71)分，Tuftsin干預組為(0.80±0.44)分，Tuftsin干預組發病小鼠的平均神經功能評分低于EAE模型組，差異具有統計學意義(P<0.05)。見圖1。各組患病小鼠表現特點為：精神萎靡，毛色暗淡，尾巴張力消失，體重下降，后肢癱瘓，個別小鼠表現為步態不穩。各組實驗小鼠發病情況見表1。

2.2組織病理染色結果

2.2.1蘇木素-伊紅染色(HE染色)光學顯微鏡下觀察各組脊髓組織的HE染色，正常對照組脊髓HE染色結構清晰，未見炎性細胞浸潤；EAE模型組脊髓組織的HE染色顯示組織結構疏松，在白質區內可見不同程度的炎性細胞浸潤，在小血管旁偶可見到淋巴細胞、單核細胞環繞，偶爾可見到小膠質細胞、巨噬細胞，亦可見到神經元的變性；Tuftsin干預組脊髓組織內可見到類似EAE模型組的改變，但炎性細胞浸潤的程度及范圍較EAE模型組有不同程度的減少。見圖2。

2.2.2髓鞘染色(Luxol fast blue染色,LFB)正常對照組脊髓組織LFB染色未見到髓鞘脫失；EAE模型組脊髓組織LFB染色可見到白質疏松，片狀的髓鞘脫失、不連續，有的呈空泡樣改變；LFB染色在Tuftsin干預組脊髓組織內亦可見到白質疏松，髓鞘淡染、不連續及脫失；Tuftsin干預組髓鞘脫失的程度及范圍小于EAE模型組，見圖2。

NamenIncidencerate(%)NeurologicalscoresTimeofonset(d)Controlgroup1000.00±0.000.00±0.00EAEgroup101001)2.00±0.711)17.5±1.671)Tuftsingroup10601)2)0.80±0.441)2)14.6±1.291)2)

Note：Comparison with Control group，1)P<0.05;Comparison with EAE group，2)P<0.05.

圖1　各組實驗小鼠在不同時間點的平均神經功能評分Fig.1　Neurological scores of each group at different stage after immunization

2.3實時定量PCR結果

2.3.1IL-10的表達變化使用RT-PCR法測得各組小鼠腦組織的TNF-α和IL-10在免疫后第28天的表達含量見表2、圖3，可以看出；正常對照組小鼠的腦組織內也有少量IL-10和TNF-α的表達。EAE模型組小鼠IL-10在免疫后第28天的表達量與正常對照組相比表達增加，差異具有統計學意義(P<0.05)。Tuftsin干預組小鼠腦組織內IL-10的表達在免疫后第28天與EAE模型組相比明顯升高且具有統計學意義(P<0.05)，其升高幅度為2.97倍。

圖2　各組實驗小鼠在免疫后第28天的HE染色和LFB染色(×200)Fig.2　HE stain and LFB stain of each group at 28th days after immunization(×200)

NamenIL-10TNF-αControlgroup60.0052±0.00130.0091±0.0039EAEgroup60.0288±0.00901)0.0354±0.01271)Tuftsingroup60.0702±0.01611)2)0.0152±0.00592)

Note：Comparison with Control group，1)P<0.05；Comparison with EAE group,2)P<0.05.

圖3　各組實驗小鼠腦組織內IL-10 及TNF-α的表達Fig.3　mRNA expression of IL-10，TNF-α by brian tissue of each group

2.3.2TNF-α的表達EAE模型組小鼠腦組織的TNF-α的表達與IL-10類似，免疫后第28天的表達與正常對照組比較差異較大，其明顯高于正常對照組。Tuftsin干預組小鼠在免疫后第28天TNF-α的表達量高于正常對照組，相較于EAE模型組明顯下降，下降幅度約為0.430倍，且差異有統計學意義(P<0.05)，見表2、圖3。

3討論

國外有研究表明Tuftsin可以改善EAE小鼠的癥狀、促進其神經功能的恢復。我們的研究通過給EAE小鼠用微量注射泵皮下緩慢注射Tuftsin，著重于比較EAE模型組與Tuftsin干預組兩組的神經功能評分和組織病理染色結果，結果發現：①Tuftsin干預組的發病率低于EAE模型組；②Tuftsin干預組的神經功能評分與EAE模型組相比明顯降低且癥狀較輕；③組織病理染色結果顯示Tuftsin干預組的炎性細胞浸潤及脫髓鞘的程度較EAE模型組減輕。因此，我們推測Tuftsin可以改善EAE小鼠的臨床神經功能癥狀及脫髓鞘的程度，這與國外相關報道結論一致。另外本研究發現Tuftsin干預組比EAE模型組的初次發病時間延遲。因此我們推測是否Tuftsin在EAE病程的早期就開始發揮作用，國內目前還未見這方面相關的報道，這也是我們進一步研究的方向。

近年來Joanna Mikita等[10]的一項研究提出：通過改變EAE模型中單核細胞M1/M2的活性模式，能夠改善EAE的臨床癥狀。Bhasin等[8]的研究同樣證實Tuftsin通過激活小膠質細胞可以減輕EAE小鼠的癥狀，并且能夠促進其神經功能的恢復。隨后他們又提出Tuftsin能夠促進Th1向Th2的轉化從而減輕EAE的癥狀。本研究結果顯示，免疫后28天Tuftsin干預組TNF-α的表達量比EAE模型組降低，而IL-10的表達量比EAE模型組高，推測這可能與T淋巴細胞或巨噬細胞的免疫表型發生改變有關。類似的研究也證實了這一觀點，Wu等[11]通過建立EAE小鼠模型體內實驗以及體外培養T細胞、小膠質細胞的研究表明Tuftsin能夠下調Th1的炎性作用、上調TH2的抗炎作用以及Treg細胞的作用從而發揮作用改善EAE的癥狀，促進其神經功能的恢復。1995年Khoruts等[12]的研究提出Th2型反應能夠抑制EAE和MS的病情發展。最近在關于炎癥性腸病動物模型和狼瘡腎炎動物模型的研究中也得出了同樣的結論，Tuftsin-PC能夠下調促炎因子 IL-1β、TNF-α和IL-17的表達，相反增加抗炎因子IL-10的表達，從而能夠防止實驗小鼠腸炎和狼瘡腎炎的發生[13,14]。本研究也支持這種可能的機制：Tuftsin能夠改變T淋巴細胞的免疫表型，通過提高Th2的抗炎作用、分泌保護性因子在中樞神經系統內發揮保護性作用，從而改善EAE小鼠的神經功能。

Tuftsin能夠促進單核細胞來源的細胞吞噬活性，如中性粒細胞、巨噬細胞、小膠質細胞等，小膠質細胞是中樞神經系統重要的免疫效應細胞。激活狀態下，小膠質細胞具有抗原提呈作用，在EAE的發病過程中，小膠質細胞激活免疫反應，參與疾病的發生，另外小膠質細胞還可以分泌一些有害的細胞因子參與MS的發病[15]。但是近年來有報道小膠質細胞具有雙重作用，在發揮有害作用的同時也對中樞神經系統發揮保護作用[16,17]。Bhasin等[8]的研究表明Tuftsin通過激活小膠質細胞可以減輕EAE小鼠的癥狀，并且可以促進其神經功能的恢復。本研究結果顯示：Tuftsin可以降低EAE小鼠脫髓鞘及炎性細胞浸潤的程度，改善EAE小鼠的神經功能，推測可能與促進小膠質細胞活性有關。

Tuftsin的促吞噬活性作用，尤其是對小膠質細胞及巨噬細胞的作用，使它成為一種潛在的免疫治療靶向，可以為臨床治療提供實驗依據。

4結論

Tuftsin在中樞神經系統內能夠發揮保護作用，降低EAE模型小鼠的炎性細胞浸潤及脫髓鞘程度，減緩EAE小鼠的癥狀、促進其神經功能的恢復。

參考文獻：

[1]陸正齊,胡學強.實驗性自身免疫性腦脊髓炎和多發性硬化研究的新動向[J].中國神經免疫學和神經病學雜志,2006,13(5):280-282.

[2]Najjar VA,Nishioka K."Tuftsin":a natural phagocytosis stimula-ting peptide[J].Nature,1970,228(5272):672-673.

[3]成軍,陳易人.Tuftsin及其作用[J].國外醫學·免疫學分冊,1989,(5):242-245.

[4]Bump NJ,Najjar VA.Tuftsin(Thr-Lys-Pro-Arg),a natural modulator of macrophage activity:further studies[J].Mol Cell Biochem,1984,63(2):137-142.

[5]Najjar VA,Constantopoulos A.A new phagocytosis-stimulating tetrapeptide hormone,tuftsin,and its role in disease[J].J Reticuloendothel Soc,1972,12(2):197-215.

[6]Fridkin M,Najjar VA.Tuftsin:its chemistry,biology,and clinical potential[J].Crit Rev Biochem Mol Biol,1989,24(1):1-40.

[7]董梅.多發性硬化的發病機制[J].國際免疫學雜志,2006,29(2):100-104.

[8]Bhasin M,Wu M,Tsirka SE.Modulation of microglial/macrophage activation by macrophage inhibitory factor(TKP)or tuftsin(TKPR)attenuates the disease course of experimental autoimmune encephalomyelitis[J].BMC Immunol,2007,8:10.

[9]Terry RL,Ifergan I,Miller SD.Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice[J].Methods Mol Biol,2014,1304:145-160.

[10]Mikita J,Dubourdieu-Cassagno N,Deloire MS,etal.Altered M1/M2 activation patterns of monocytes in severe relapsing experimental rat model of multiple sclerosis.Amelioration of clinical status by M2 activated monocyte ad ministration[J].Mult Scler,2011,17(1):2-15.

[11]Wu M,Nissen JC,Chen EI,etal.Tuftsin promotes an anti-inflammatory switch and attenuates symptoms in experimental autoimmune encephalomyelitis[J].PLoS One,2012,7(4):e34933.

[12]Khoruts A,Miller SD,Jenkins MK.Neuroantigen-specific Th2 cells are inefficient suppressors of experimental autoimmune encephalomyelitis induced by effector Th1 cells[J].J Immunol,1995,155(10):5011-5017.

[13]Ben-Ami SD,Bashi T,Lachnish J,etal.Phosphorylcholine-tuftsin compound prevents development of dextransulfate-sodium-salt induced murine colitis:implications for the treatment of human inflammatory bowel disease[J].J Autoimmun,2015,56:111-117.

[14]Bashi T,Blank M,Ben-Ami SD,etal.Successful modulation of murine lupus nephritis with tuftsin-phosphorylcholine[J].J Autoimmun,2015,59:1-7.

[15]呂佩源,宋春風,李春巖.小膠質細胞與多發性硬化[J].國外醫學.神經病學神經外科學分冊,2000,27(5):270-272.

[16]吳鑒今.小膠質細胞在多發性硬化中的兩面性作用[J].中國實用神經疾病雜志,2011,14(12):89-92.

[17]Rawji KS,Yong VW.The benefits and detriments of macrophages/microglia in models of multiple sclerosis[J].Clin Dev Immunol,2013,2013:948976.

[收稿2015-07-25修回2015-08-21]

(編輯倪鵬)

Tuftsin can attenuates symptoms in experimental autoimmune encephalo-myelitis mouse

JIANa,WUQiao-Li,JIYong,XUXiao-Lin.

TiangjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China

[Abstract]Objective:To explore whether Tuftsin can attenuates symptoms in experimental autoimmune encephalomyelitis mouses.Methods: C57BL/6 mice were immunized with MOG35-55 peptides,and evaluated for clinical neurological score every day.10 mice of the EAE were injected with Tuftsin subcutaneously.The spinal cord were stained by the methods of Haematoxylin Eosinstain,Luxol Fast Blue stain.The mRNA expression of IL-10 and TNF-α from brian tissue were detected at the 28 days by RT-PC method.Results: The controlled mice had no symptoms of disease and HE,LFB were normal.Comparison EAE group with Tuftsin group of HE,LFB,EAE group were server than Tuftsin group.The expression of IL-10 in Tuftsin group was higher than EAE group.The expression of TNF-α in Tuftsin group was lower than EAE group.Conclusion: Tuftsin can attenuates symptoms in experimental autoimmune encephalomyelitis mouses.

[Key words]Multiple sclerosis；Experimental autoimmune encephalomyelitis;Tuftsin

中圖分類號R744.5

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)03-0323-05

作者簡介：賈娜(1987年-)，女，在讀碩士，主要從事腦血管病研究，E-mail:Xjunnana@163.com。通訊作者及指導教師：徐小林(1963年-)，男，碩士，主任醫師，碩士生導師，主要從事腦血管病的基礎與臨床方面的研究，E-mail：hhyyxxl@163.com。

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.03.006

①本文為天津市應用基礎與前沿技術研究計劃自然科學基金一般項目(M0101)。

②天津市環湖醫院，天津300060。