生物監測方法在環境監測中的應用

■李越

（包頭市環境監測站內蒙古包頭014060）

生物監測方法在環境監測中的應用

■李越

（包頭市環境監測站內蒙古包頭014060）

總結了近年來現代生物技術在環境領域的應用情況，著重介紹了現代生物技術在環境監測與評價、環境工程領域的新型實用成果，并就該技術在環境領域的應用前景和發展趨勢進行了分析。

現代生物技術 環境監測 生物傳感器 PCR

現代生物技術是指以 DAN 技術為先導，包括微生物工程細胞工程、酶工程、基因工程、蛋白質工程和生物修復技術在內的一系列生物高新技術的統稱。現代生物技術與其他高新技術產業一樣具有效益高、開發周期短的特點，現已經過了基礎理論研究發展階段，自 70 年代末以來，已開始了大規模工程應用的實用階段。現代生物技術不僅廣泛應用于食品工業、高新技術農業、藥品和發酵工業，而且在日益嚴重的環境污染的監測評價與防治等方面發揮著不可替代的作用。可以預言，在今后的一段時間內，現代生物技術將成為環境科學領域重點開發和應用的技術手段。

1 生物傳感器

隨著科技的發展，以及各學科的融合交叉，以 DNA 重組技術為標志的現代生物技術正被利用到環境監測領域，構成了現代生物監測技術。在環境監測領域，現在廣泛使用的生物監測技術主要是將生物反應轉化為電信號的生物傳感器。

生物傳感器是以固定化細胞核、固定化酶技術為基礎，以生物學元件作為功能性識別元件，識別和感知目的被測物并將其按一定規律轉化為可識別信號的器件或裝置，其工作原理是：生物組分與待測對象發生相互作用，通過電子組分將待測對象檢出并轉化為可測量的電子信號。

生物傳感器在環境監測中起著越來越重要的作用。固定化生物層與目標污染物之間的專一性作用是設計生物傳感器的理論基礎，基于生物催化（酶、微生物等）和免疫原理的生物傳感器已在環境領域中獲得了廣泛應用。然而利用核酸探針為敏感元件的傳感器在環境監測中開發應用尚處于起步階段。分子生物學與生物技術的進展為研究DNA 生物傳感器提供了可能。與酶和抗體不同，核酸識別層十分穩定，并且易于合成或再生以供重復使用。DNA 生物傳感器為生物傳感器家族中添加了新的成員，DNA 傳感器的實現需要正確地選擇核酸探針及其固定化和 DNA 識別信號的有效轉換與檢測。毫無疑問，隨著該項技術的不斷深入研究和日臻成熟，DNA 生物傳感器將成為環境污染監測領域中的一個重要手段。

2 PCR技術

PCR 技術模擬 DNA 的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的引物，該原理主要包括 3 個基本反應過程：變性———退火———延伸。變性主要是指雙鏈 DNA 的變性，即雙鏈 DNA 經加熱至93℃左右，其熱穩定性降低，配對堿基之間的氫鍵斷裂，使雙鏈 DNA成為單鏈，以便與引物結合。退火是指單鏈 DNA 在溫度降低時與引物的復性（稱為退火）。在此過程中，引物與單鏈 DNA 模板仍然按照堿基互補的方式配對。延伸是指引物與 DNA 模板按堿基互補的原則配對后，在 TaqDNA聚合酶的作用下，以 dNTP 為反應原料，進行體外的半保留復制，合成一條新的與模板 DNA 鏈互補的新鏈。經重復循環變性———退火———延伸 3 個過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一次循環需2￣4min，2￣3h 就能將目的基因擴增、放大幾百萬倍。過去幾天幾星期才能做到的事情，用 PCR 幾小時便可完成。PCR 技術的發明是分子生物學的一項革命，極大地推動了分子生物學以及生物技術產業，并被迅速推廣和應用到其他領域。

在眾多的污染物中，生物污染（病原菌、病毒及其它一些有害生物）直接威脅著人類的健康。傳統的檢測方法需要對樣品進行分離培養，往往要花上幾天乃至數周的時間，而且有些致病菌或病毒難以人工培養，給檢測帶來困難，而 PCR 技術的應用，克服了上述不足。與傳統生物檢測方法相比，PCR 方法不僅檢測時間短、靈敏度高，還可以檢測出一些依靠培養法不能檢測的微生物種類。PCR方法已經在微生物檢測中有了比較深入而廣泛的研究，并取得了較好的應用成果。

PCR 技術反應能夠被自然界中一些物質所抑制，例如胡敏酸、富里酸、某些離子及糖類物質等可以干擾 Taq 聚合酶的作用。同樣，環境水樣在濃縮、保存和提純過程中可能從環境及中間處理環節帶來一些潛在的 PCR 反應抑制劑，例如 EDTA、十二烷基硫酸鈉等；另外還可能有一些共存物質抑制 PCR 反應。這些抑制劑一方面可能抑制 PCR反應，另一方面還可能造成假陽性結果。因而，研究環境樣品中待擴增DNA 或 RNA 的提純技術以消除抑制物的影響是十分重要的。由于DNA 的檢測并不意味著必須使用活細胞，因而任何可以提供核酸物質的樣品都可以進行PCR 擴增，也就是說 PCR 不能區分活細胞和死細胞，尤其是在水體衛生學檢驗中不能確定所檢出的病毒粒子是否具有感染能力，這是一個待解決的問。

近些年來，基于 PCR 的基本原理，許多學者充分發揮創造性思維，對 PCR 技術進行研究和改進，使 PCR 技術得到了進一步地完善，并在此基礎上派生出了許多新的 PCR 技術，如熒光 PCR、反轉錄PCR、原位 PCR、單細胞 PCR 等，以及這些技術相互融合，為生命科學領域的研究打開了一扇扇新大門，為分子生物學研究的深入開展提供了高質量的技術保障，也為環境保護提供了方便、快捷、靈敏的檢測手段。

3 生物芯片（Bioships）

生物芯片是一種通過微加工技術和微電子技術將生物探針分子（寡聚核苷酸、cDNA、基因組 DNA、多肽、抗原、抗體等）固定在硅片、玻璃片、塑料片、凝膠、尼龍膜等固相介質表面而構建的微型生物化學分析系統，可以對細胞、蛋白質、DNA 以及其他生物組分進行準確、快速和大信息量的檢測。

在環境監測和環境保護上，可以利用生物芯片快速檢測污染微生物或有機化合物對環境、人體、動植物的污染和危害。在環境監測方面的應用主要有：水質控制、檢測藥物、食物添加劑或化學物質毒性以及環境中有害細菌的監測。利用生物芯片技術能夠同時快速地檢測多種環境中的常見致病菌。

4 PCR- DGGE 技術

由于 DNA 分子中 AT 堿基對與 GC 堿基對的鍵間結合力的不同，造成不同序列的 DNA 分子的解鏈溫度不同，解鏈需要的變性劑的濃度也不同。當 DNA 分子在含梯度變性劑的聚丙烯酰胺凝膠中電泳時，序列不同的 DNA 片段就會在各自相應的變性劑濃度下變性，形成向三個方向延伸的片段，這種形狀的DNA 分子電泳遷移速度相應降低很多，這樣不同序列的 DNA片段滯留于凝膠的不同位置，染色后會看到形成一條條的譜帶。

為調節目的序列的解鏈程度，取得好的分離效果，通常采用 GC夾板的形式，在 PCR 引物的 5 末端連接上一段長度為 30￣50 堿基富含GC 的核苷酸序列，使相差一個堿基的序列也能分辨分離。該技術主要包括 6 個步驟：（1）樣品總 DNA 提取；（2）樣品 16SrDNA 片段的 PCR 擴增及純化；（3）制膠；（4）樣品的 DGGE 分析；（5）染色；（6）割膠測序。

由于 PCR－ DGGE 技術克服了傳統微生物學方法的局限性，自Muyzer等開辟了 DGGE 在微生物生態領域研究的先河以來，該技術迅速發展成為環境微生物群落結構分析研究的主要手段之一。近年來，DGGE 用于環境微生物種群的研究越來越多，涉及的領域也越來越廣泛，在國外 DGGE 技術已經被廣泛用于活性污泥、生物膜等生物處理系統中的微生物多樣性檢測、微生物鑒定以及種群演替等方面的研究。

PCR－ DGGE 技術只能分離較小的片段（達 500bp），較長的片段分離率下降，限制了用于系統發育分析和探針的序列信息量。由于某些種類 16SrDNA 的拷貝之間的異質性問題及異源核酸雙鏈分子的檢出可能會導致細菌數量的過多估計。在有些情況下，不同類型的細菌種群 16SrDNA 有著相同的遷移行為，一條DGGE 條帶是由不同細菌種群序列組成，這可能會低估環境微生物的種群多樣性。

隨著科學技術的不斷發展，環境監測技術也在向更精細、更準確、更靈敏的方向發展。同時，生物技術在環境監測領域中日趨重要的地位和作用，充分說明拓寬學科的研究領域，加強學科間的交流、滲透和合作，對于科學的整體發展和進步是至關重要的。

[1]李宗義,邵強,郭偉云等.用于環境監測的生物傳感器 [J].生物技術.2005.15(4): 95-98.

[2]王建龍.DNA生物傳感器在環境污染監測中的應用 [J].生物化學與生物物理進展. 2001.28(1):125-127.

[3]鄧小紅,任海芳.PCR技術詳解及分析 [J].重慶工商大學學報 (自然科學版). 2007.24(1):29-33.

X83[文獻碼]B

1000-405X（2016）-5-415-2