槲皮素在聚L-絡氨酸修飾電極上的電化學行為及測定

楊 銀 張 娜 汪 麗 張克營* 郝玲玲 劉 晨 楊柳青

(1 宿州學院 化學化工學院，安徽 宿州 234000；2 宿州學院 體育學院，安徽 宿州 234000)

槲皮素在聚L-絡氨酸修飾電極上的電化學行為及測定

楊 銀1張 娜1汪 麗1張克營1*郝玲玲1劉 晨2楊柳青2

(1 宿州學院 化學化工學院，安徽 宿州 234000；2 宿州學院 體育學院，安徽 宿州 234000)

采用電聚合方法制備了聚L-絡氨酸修飾電極。利用循環伏安法(CV)探究了pH值、掃描速率對槲皮素電化學行為的影響。用差分脈沖伏安法(DPV)對槲皮素進行測定。結果表明：聚L-絡氨酸修飾電極在pH值為6.0的磷酸鹽緩沖溶液中對槲皮素表現出良好的電催化能力。在6.21×10-5～6.9×10-4mol/L范圍內槲皮素的濃度與相應的檢測信號呈現出良好的線性關系，線性方程為：I(10-6A)=-1.034 8-0.099 39c(10-4mol/L)，線性相關系數R=-0.987 87，檢出限為2.07×10-5mol/L(S/N=3)。電化學分析方法簡易快捷、重現性和穩定性高。

L-絡氨酸；修飾電極；槲皮素；電催化

0 引言

借以電化學的方法在電極表面聚合某種氨基酸，得到氨基酸薄膜并研究其生理活性，已是許多化學研究者關注的焦點。例如馮玉翔等[12]在玻碳電極上聚合上L-賴氨酸以制備聚L-賴氨酸修飾電極用于甲基對硫磷的伏安行為的研究及檢測，實驗結果令人滿意。孫登明等[13]制備了聚L-絡氨酸修飾電極并通過循環伏安法研究了多巴胺的電化學行為，建立了一種微量或痕量測定物質的新方法。目前，電聚合制備修飾電極的方法已是生產和科研中廣泛應用的一種實驗手段[14]。該方法實驗儀器設備和操作步驟簡單、分析速度快、較高的準確度和靈敏度、操作條件易于控制、尤其是檢測過程的電信號，便于實現自動化或連續分析。

氨基酸化學修飾電極[15]因電極表面氨基酸薄膜不易脫落、較為穩定、制備方法簡易、可產生明顯的電化學信號，因此在電化學相關領域此技術得到廣泛的認可，并有著快速的發展。其中L-絡氨酸因其內部的官能團在電催化氧化作用下，可形成離子形式的自由基，該自由基經過擴散在玻碳電極表面以共價鍵合，最終可在玻碳電極表面形成更加均勻穩定，高效致密的氨基酸有機薄膜。所得修飾電極可利用其三維空間結構，為檢測的環境提供多種可利用的勢場，也非常利于電催化作用。這一性質在氨基酸修飾電極薄膜的制備方面開啟了一種新思路，新方法。例如李容等探究了吡蟲啉在聚L-絡氨酸修飾電極上有極好的電催化性能，建立了一種直接，高效測定吡蟲啉的新途徑[16]。此外L-絡氨酸制備來源很廣泛，制取方法易于實現。在醫學方面、藥品制作、生化試驗、農業、科學研究等多個領域均有著重要作用。

本文主要是在裸玻碳電極表面修飾上L-絡氨酸得到聚L-絡氨酸修飾電極并利用循環伏安法(CV)探究了影響槲皮素電化學行為的最優測定條件，并使用差分脈沖伏安法對槲皮素進行測定。故而此方法在槲皮素的檢測領域擁有十分重要的應用價值。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

KQ5200DB數型控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，CHI660D電化學工作站(上海辰華儀器公司)，pHS-3C型酸度計(上海雷磁儀器廠)，電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)，可檢測電化學信號的三電極體系： 以飽和甘汞電極(SCE)為參比電極，裸玻碳電極(GCE)或聚L-絡氨酸修飾電極為工作電極，鉑絲電極作為輔助電極。

槲皮素；L-絡氨酸；磷酸鹽緩沖溶液；實驗所需的其它試劑均為使用前未進一步處理的分析純。實驗用水均為二次蒸餾水，實驗整個過程均在室溫下進行操作。

槲皮素溶液(1.0×10-2mol/L)的配制：稱取0.077 g槲皮素于25 mL的容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度線，搖勻，待用。

設備在進入實際的施工現場過程中，需要技術部門對設備的性能方面進行分析與研究，并制定相應的實際操作規范指引，引導員工進行正確的手法使用相關的設備，同時也要求后勤部門對設備方面進行相關的監督管理做到設備的日常點檢儀保養工作。同時采購部核對倉庫的設備配件的實際庫存情況，定期的有效及時的采購所需要的設備方面的配件，可以提高設備方面的使用效率以及延長設備的使用壽命，需要建立一個統一性的部門配合制度來推進施工現場的設備管理的系統化與科學法。

L-絡氨酸溶液(5.0×10-3mol/L)的配制：稱取0.036 5 g L-絡氨酸于50 mL容量瓶中，加入蒸餾水使其緩慢溶解，直至稀釋至刻度線，充分搖勻，待用。

磷酸鹽緩沖溶液(0.2 mol/L)的配制：采用濃度均為0.2 mol/L的NaH2PO4和Na2HPO4混合溶液配制磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，并用H3PO4和NaOH調節pH值。

1.2 修飾電極的制備

將裸玻碳電極先在濕潤的金相砂紙上打磨，在三氧化二鋁粉末的懸浮液中進行打磨拋光，將玻碳電極依次置于硝酸(1+1)、無水乙醇中，超聲清洗各2 min，再用二次蒸餾水淋洗，并用濾紙吸干。將處理好的玻碳電極放入濃度為5.0×10-3mol/L的L-絡氨酸的磷酸鹽緩沖溶液(pH=9)的電解池中，以100 mV/s的掃描速率，電位區間在-0.7～2.2 V內，掃描圈數為5周，掃描結束后取出，備用。

1.3 實驗方法

實驗主要利用CHI660D電化學工作站記錄電流響應信號，三電極系統。將修飾電極置于含有一定濃度的槲皮素的磷酸鹽緩沖溶液中，循環伏安法掃描速率設置為100 mV/s，在電位范圍為-0.7～2.2 V，運用循環伏安法(CV)探究了槲皮素在陰陽兩電極上的伏安行為。利用電化學阻抗法對不同修飾電極薄膜的電化學性能進行表征。以及用差分脈沖伏安法(DPV)記錄相應檢測信號的大小，實現對槲皮素的測定。為保持修飾電極具有良好的重現性和穩定性，每次實驗結束后將三電極放入空白溶液中，多次掃描至沒有明顯的峰出現。

2 結果與討論

2.1 L-絡氨酸的電聚合圖

圖1是濃度為5.0×10-3mol/L 的L-絡氨酸在PBS(pH=9.0)中的連續循環伏安曲線圖。電位掃描范圍在-0.7～2.2 V。由圖1可見，在掃描第一圈時，出現了一個明顯的氧化峰，氧化峰電位位于0.63 V，并且隨著掃描圈數的增加，槲皮素的氧化峰電流逐漸增大，峰電位基本不變，當掃描至第四圈時，氧化峰電流變化幅度有所減小，當掃描至第五圈時，氧化峰電流基本保持不變，說明電聚合基本結束。隨著掃描圈數的增加，可觀察到電極表面變暗，可推知L-絡氨酸在玻碳電極表面發生了聚合，故所制的電極為聚L-絡氨酸修飾電極。

圖1 L-絡氨酸(5.0×10-3 mol/L)聚合過程 的連續循環伏安曲線(掃描速率為100 mV/s)Figure 1 Cyclicvoltammograms for L-Tyrosine.

2.2 修飾電極的交流阻抗表征

不同電極表面的有機薄膜的化學性質的差異可采用電化學阻抗法進行表征。圖2描述了不同電極在磷酸鹽緩沖溶液(0.2 mol/L，pH=6.0)含5 mmol/L的K4Fe(CN)6∶K3Fe(CN)6(1∶1)中的交流阻抗圖。實驗的工作電位是0.22 V。從圖2中可以看出當L-絡氨酸聚合到玻碳電極表面時，可以看到阻抗半徑非常微小，幾乎消失，說明聚L-絡氨酸修飾電極的電阻比較小，帶電離子可容易傳輸到有機薄膜表面發生化學反應。證明了L-絡氨酸已經成功地聚合到玻碳電極表面且能夠提高電子轉移速率。

圖2 不同電極的交流阻抗圖Figure 2 Nyquist plots of bare GCE poly (L-Tyrosine)/GCE in PBS.

2.3 槲皮素在修飾電極上的伏安特性

圖3為1.0×10-2mol/L槲皮素在裸玻碳電極(曲線a)和聚L-絡氨酸修飾玻碳電極(曲線b)上的循環伏安曲線。由圖3可知，槲皮素在裸電極表面有微弱的電流響應信號，而在聚L-絡氨酸修飾玻碳電極上產生一對明顯的氧化還原峰，氧化峰電流值為1.232×10-5A，還原峰電流值為1.007×10-5A。結果表明聚L-絡氨酸修飾電極對槲皮素的氧化還原反應有著較好的催化能力。故而，該聚L-絡氨酸修飾電極制備成功。

圖3 槲皮素在不同電極上的循環伏安曲線圖Figure 3 Cyclic voltammetry digrams for quercetin detected at bare GCE and L-Tyrosine/GCE.

2.4 最優條件的選擇

2.4.1 pH的影響

酸度對槲皮素的測定有著十分重要的影響，在pH值為4.0～9.0的范圍內，利用循環伏安方法考察了槲皮素在不同酸度緩沖液的伏安行為。圖4A是槲皮素的氧化峰電流在不同酸度下的變化曲線圖。由圖4A可知，當pH值從4.0增加到6.0時，槲皮素氧化峰電流不斷增大。當pH值達到6.0時，槲皮素的氧化峰電流值最大，當pH值從6.0增加到8.0時，隨著pH值的升高，槲皮素氧化峰電流反而降低。因此在整個實驗過程均是在pH值為6.0的磷酸鹽緩沖溶液中進行。圖4B是槲皮素的氧化峰電位在不同酸度下的變化曲線圖。由圖4B可見，隨著pH值的增大，槲皮素的氧化峰電位明顯負移且構成一定的變化規律，兩者之間的線性回歸方程為：E(V)=-0.058 0pH+0.588 6相關系數R為-0.9808。由dEp/dpH=0.058(V/pH)，說明槲皮素在電極上反應的電子轉移數和參與反應的質子數相等。

圖4A pH值對槲皮素的氧化峰電流的影響Figure 4A Effects of PH on oxidation peak current of quercetion.

圖4B pH值對槲皮素的氧化峰電位的影響Figure 4B Effects of PH on oxidation peak voltage of quercetin.

2.4.2 掃描速率的影響

圖5A是1.0×10-2mol/L槲皮素在pH值為6的磷酸鹽緩沖溶液中在聚L-絡氨酸修飾電極上的循環伏安曲線。由圖可知：隨著掃描速率的增大，槲皮素的峰電流增加，氧化峰電位正移，還原峰電位負移。圖5B、5C分別為槲皮素的峰電流與掃描速率之間的關系。在掃描速率為20～180 mV/s范圍內，槲皮素的峰電流與其掃描速率成良好的一次線性關系，線性方程分別為i(10-6A)=-0.528 67-6.794 75v(V/s)(R1=-0.992 01)；i(10-6A)=0.435 8+5.4v(V/s)(R=0.991 56)。結果表明，槲皮素在聚L-絡氨酸修飾電極薄膜上發生的化學反應是吸附控制過程。從圖5D可知：還原峰電位和掃描速率的對數成良好的一次線性關系，線性相關方程為E=0.180 65-0.067 5lgv，R=-0.995 91。根據文獻[15]可知槲皮素的電極反應過程質子的參與數為2。

圖5A 不同掃速條件下的聚L-絡氨酸修飾電極的循環伏安圖Figure 5A CV of L-Tyrosine/GCE under the condition of different scanning rate in the PBS (pH=6.0) containing 1.0×10 -2 mol/L quercetin.

圖5B 掃描速率和槲皮素的氧化峰電流之間的關系Figure 5B Relationship between oxidation peak current of quercetin and scan rate.

圖5C 掃描速率和槲皮素的還原峰電流之間的關系Figure 5C Relationship between reduction peak current of quercetin and scan rate.

圖5D 掃描速率與槲皮素還原峰電位之間的關系Figure 5D Relationship between reduction peak potential and scan rate.

2.5 工作曲線和檢出限

在最優的實驗條件下，采用示差脈沖伏安法(DPV)分別研究了槲皮素的氧化峰電流與其濃度的關系，由圖6A可知，不同濃度的槲皮素在聚L-絡氨酸修飾電極上可檢測到穩定且明顯的電流響應信號。隨著槲皮素濃度的增加，峰電流逐漸增加。由圖6B可知槲皮素濃度在6.21×10-5～6.9×10-4mol/L和其氧化峰電流之間有良好的線性關系，線性方程I(10-6A)=-1.034 8-0.099 39c(10-4mol/L)相關系數R1為-0.987 87，檢出限為2.07×10-5mol/L。

圖6A 不同濃度的槲皮素在聚L-絡氨酸修飾電極上的DPV曲線Figure 6A DPV diagram of different concentrations of quercetin on the modified electrode in 0.2 mol/L PBS.

圖6B 槲皮素的濃度和其氧化峰電流的關系Figure 6B Linear relationship between concentration of quercetin and oxidation peak current.

2.6 穩定性、重現性實驗

將制備好的聚L-絡氨酸修飾電極連續掃描20圈，用于同濃度的槲皮素的檢測，未發現有明顯的峰電流變化，將聚L-絡氨酸修飾電極同時置于PBS(0.2 mol/L，pH=6.0)中室溫下兩天，用于同濃度槲皮素的檢測，沒有發現明顯的峰電流變化。說明在該修飾電極上對電流響應信號起著顯著的穩定功能。分別制備三個聚L-絡氨酸修飾電極檢測同濃度的槲皮素，相對標準偏差在可接受的范圍內，說明該修飾電極對槲皮素的測定具有很好的重現性。

3 結論

在最佳的實驗條件下，利用循環伏安法將L-絡氨酸電聚合修飾于玻碳電極上，制備出對槲皮素有良好電催化作用的聚L-絡氨酸修飾電極，建立了一種直接測定槲皮素的簡易快速，便于普及的電化學分析方法。在6.21×10-5～6.9×10-4mol/L范圍內槲皮素的濃度與相應的檢測信號呈現出良好的一次線性關系，線性方程為：I(10-6A)=-1.034 8-0.099 39c(10-4mol/L)(R=-0.987 87)，檢出限為2.07×10-5mol/L。結果表明聚L-絡氨酸修飾電極對槲皮素的測定有較低的檢測限，此外，聚L-絡氨酸修飾電極還表現出較好的穩定性和重現性。

[1] 廖文利,李忠彬,李念兵.抗壞血酸在聚L-谷氨酸修飾玻碳電極上的電化學行為研究[J].重慶文理學院學報(JournalofChongqingUniversityofArtsandSciences),2010,29(5):57-61.

[2] Caomano M M, Garcia L V,Elorza B. Improved RPLC determination of acyclovir using hexylamine as silanol masking agent[J]. Pharm Biomed .nal., 1999,21(3):619-624.

[3] 陳明俊.槲皮素化學修飾碳糊電極循環伏安法測定抗壞血酸[J].理化檢驗：化學分冊(PhysicalTestingandChemicalAnalysis:ChemicalAnalysis),2012,48(10):1174-1176.

[4] 趙美蓮,倪丹丹,王建文,等.直接電沉積金納米粒子修飾氧化銦錫電極測定亞硝酸根[J].分析化學(JournaloftheAmericanChemicalSociety),2008,12(4):1729-1731.

[5] 周學酬,鄭新宇,呂日新,等.槲皮素在聚谷氨酸修飾玻碳電極上的伏安行為及檢測[J].分析試驗室(ChineseJournalofAnalysisLaboratory),2012,31(5):34-37.

[6] 朱玲艷,王宗花,陳小印,等.聚吡咯/碳納米管分子印跡修飾電極對槲皮素的選擇性測定[J].分析測試學報(JournalofInstrumentalAnalysis),2011,30(1):18-23.

[7] Jin WR, Wei HY, Zhao X. Determination of adenine and guanine by capilly zone electrophoresis with end-column amperometric detection at a carbon fiber microdisk array electrode[J]. Electroanalysis,1997,19(4):770-774.

[8] Pejic N, Kuntic V, Vujic Z, et al.Direct spectrophotometric determination of quercetin in the presense of ascorbic acid[J]. Il Farmaco,2004,59(1):21-24.

[9] 劉進邦,孟昭仁.雙波長疊加法測定樣品中槲皮素含量[J].分析科學學報(JournalofAnalyticalScience),2006,22(5):617-620.

[10] 許雪琴,游俊,陳國南.槲皮素的陽極伏安行為研究[J].福州大學學報:自然科學版(JournalofFuzhouUniversity:NaturalScienceEdition), 2003,31(4):485-487.

[11] 方浩,吳孝增,張娜,等.槲皮素在氧化鋯修飾玻碳電極上的伏安行為及檢測[J].中國無機分析化學(ChineseJournalofInorganicAnalyticalChemistry),2013,3(4):65-68.

[12] 馮玉翔,張升暉.電聚合L-賴氨酸膜修飾電極對甲基對硫磷的檢測研究[J].湖北民族學院學報:自然科學版(JournalofHubeiInstitudeforNationalities:NaturalScienceEdition),2012,30(1):15-17.

[13] 孫登明,張振新,馬偉,等.聚L-絡氨酸修飾電極的制備及對多巴胺的測定[J].分析試驗室(ChineseJournalofAnalysisLaboratory),2005,24(7):28-30.

[14] 趙志偉,申貴雋,谷靈燕.DL-賴氨酸-β-環糊精/碳納米管修飾電極的制備與應用研究[J].中國無機分析化學(ChineseJournalofInorganicAnalyticalChemistry),2015,5(1):70-74.

[15] 王春燕,李云輝,田堅,等. 氨基酸化學修飾電極的制備及其應用[J].長春理工大學學報:自然科學版(JournalofChangchunUniversityofScienceandTechnology:NaturalScienceEdition), 2011,34(1):150-152.

[16] 李容,蔣曉麗,池永明,等. 吡蟲啉在聚L絡氨酸修飾電極上的電化學行為及其測定[J].分析測試學報(JournalofInstrumentalAnalysis),2010,29(5):502-506.

[17] 陳小印,王宗花,張菲菲,等.槲皮素在聚對氨基苯磺酸修飾電極上的電化學研究[J].青島大學學報:工程技術版(JournalofQingaoUniversity:EngineedringTechologyEdition),2010,25(1):54-57.

Electrochemical Behaviors and Determination of Quercetin at Poly (L-Tyrosine) Modified Electrode

YANG Yin1, ZHANG Na1, WANG Li1, ZHANG Keying1*, HAO Lingling1, LIU Chen2, YANG Liuqing2

(1.DepartmentofChemistry-Biology,SuzhouUniversity,Suzhou,Anhui234000,China； 2.DepartmentofPhysicalEducation，SuzhouUniversity，Suzhou，Anhui234000,China)

A poly (L-Tyrosine) modified electrode was prepared by electro-polymerization technology. The electrochemical behavior on pH and scan rate was investigated by cyclic voltammetry (CV). The contents of quercetin were determined using differential pulse voltammetry (DPV). The results indicated that the modified electrode showed a good electric catalytic ability for quercetin in phosphate buffer solution with pH=6.0. Linear relationship between the oxidation peak current and the concentrations of quercetin was obtained in the range of 6.21×10-5～6.9 ×10-5mol/L. The linear equation wasI(10-6A) =1.034 8-0.099 39c(10-4mol/L) with correlation coefficient (R) of -0.98787. The detection limit (S/N=3) was 2.07×10-5mol/L. The method has fast analytical speed, good accuracy, high reproducibility and stability.

L-Tyrosine; modified electrodes; quercetin; electric catalytic

10.3969/j.issn.2095-1035.2016.01.020

2015-10-29

2015-12-09

國家創新創業項目(201510379037)；省級創新創業項目(AH201510379051)；宿州學院大學生科研立項(KYLXLKZD15-01；KYLXLKYB15-25)資助

楊銀，女，學生，主要從事應用化學研究。

*通信作者：張克營，男，講師，主要從事電分析化學研究。E-mail: zhangky1983@163.com

O657.1；TH832

A

2095-1035(2016)01-0077-06