納米二氧化硅粒子的制備及對BSA結構的影響

李偉瀚 田珍珍 周鶴林 王宜美 徐 暢 張懷斌

(濱州醫學院 藥學院，山東 煙臺 264003)

納米二氧化硅粒子的制備及對BSA結構的影響

李偉瀚 田珍珍 周鶴林 王宜美 徐 暢 張懷斌

(濱州醫學院 藥學院，山東 煙臺 264003)

在堿性條件下水解正硅酸乙酯(TEOS)制備納米二氧化硅(SiO2)粒子，并采用同步熒光光譜和紫外可見分光光度法探討了SiO2對牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)結構的影響。結果顯示，SiO2納米粒子對BSA的結構沒有發生顯著的影響，這說明在實驗條件下，SiO2不會改變BSA分子的結構和微環境。

二氧化硅；牛血清白蛋白；同步熒光光譜；紫外可見分光光度法

0 引言

納米二氧化硅具有良好的物理化學性能，在生物醫藥領域受到廣大研究者的青睞，經常被用作靶向藥物的載體[1-4]。二氧化硅在被廣泛應用同時，其對人體及其環境的毒性效應也日益受到人們的高度關注。例如：趙峰等[5]研究發現納米SiO2顆粒可降低血管內皮細胞活力，破壞細胞膜完整性，損傷線粒體，導致線粒體膜電位下降，最終發生細胞凋亡；納米粒子可以隨血液進入體內的各個組織器官[6]，并可以引起大鼠肺、肝、心等器官不同程度的損傷[7]。這些研究主要集中在納米二氧化硅對細胞和活體動物的毒性方面，而在分子水平上研究二氧化硅對蛋白質的毒性作用方面國內鮮見報道[8]。蛋白質是組成生物體的重要物質，牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)因與人血清白蛋白具有相似的結構常作為體外模型蛋白[9]。鑒于上述原因，本文制備出了二氧化硅納米粒子，探討了二氧化硅納米粒子對BSA結構的影響，為二氧化硅在生物醫學領域的應用和安全性評價方面提供一些參考依據。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

正硅酸乙酯(TEOS)、氨水、異丙醇(IPA)、牛血清白蛋白(BSA)、pH=7.4的Tris-HCl緩沖溶液、無水乙醇等均為分析純，購自國藥集團；水為二次蒸餾水。用Tris-HCl緩沖溶液配制濃度為1.0×10-5mol/L的BSA溶液，4 ℃的冰箱中儲存備用。

TG16-WS臺式高速離心機(上海儀器廠)，GL-2型恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責任公司)，JEM-1400透射電子顯微鏡(日本株式會社)，55型Fourier紅外光譜儀(德國Bruker公司)，TU-1901紫外可見分光光度計(北京普析儀器公司)，LS55熒光儀(美國, PerkinElemer公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 納米SiO2粒子的制備

參照文獻[10]，量取16.5 mL IPA，16 mL氨水，28 mL蒸餾水于圓底燒瓶中，磁力攪拌均勻，加入60 mL TEOS溶液(1%，v:v，TEOS/IPA)，攪拌20 min，然后緩慢滴加6.0 mL TEOS，攪拌反應6 h，離心得到白色二氧化硅(SiO2)，分別用乙醇、蒸餾水洗滌3次，烘箱中50 ℃烘干備用。

稱取10.70 mg SiO2納米粒子研細，超聲分散到50 mL蒸餾水中。每次使用前都超聲分散均勻。

1.2.2 納米SiO2粒子與BSA相互作用的光譜測試

取3 mL BSA溶液于石英比色皿中，依次加入一定量的納米SiO2分散液，混合均勻，靜置5 min，設定激發和發射波長的差值分別為15 nm和60 nm，在220～320 nm范圍內進行同步熒光測定。

將上述BSA與納米SiO2的混合溶液在200～400 nm范圍內測定其紫外可見吸收光譜強度。

2 結果與討論

2.1 納米SiO2粒子的表征

圖1是SiO2納米粒子的透射電鏡圖，制備的SiO2納米粒子呈球形均勻分布，表面光滑，直徑約為220 nm。

圖2是SiO2納米粒子的Fourier紅外光譜圖，圖中1 636 cm-1處的峰是納米二氧化硅表面羥基的特征峰，1 112、796和453 cm-1處的峰分別對應于Si-O-Si鍵的反對稱伸縮振動、對稱伸縮振動和彎曲振動的吸收峰，952 cm-1處的峰是Si-OH的伸縮振動峰[10-11]。

圖1 SiO2納米粒子的透射電鏡照片Figure 1 TEM image of SiO2 nanoparticles.

圖2 SiO2納米粒子的FTIR紅外光譜圖Figure 2 FTIR spectra of SiO2 nanoparticles.

2.2 納米SiO2粒子對BSA結構的影響

BSA分子中因含有苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸發色團而具有熒光。同步熒光技術在分析BSA分子微環境的變化方面具有較高的靈敏性。同步熒光發射峰位置的改變可以反映發色團微環境極性的變化，進而判斷物質對BSA結構的影響[12-13]。圖3是BSA在不同濃度(SiO2濃度由上到下分別為：0、1.33、2.63、3.92、5.19、6.45×10-3mg/mL)納米SiO2分散體系中的同步熒光光譜圖，圖3A是色氨酸的同步熒光光譜圖，當SiO2與BSA相互作用時，色氨酸的同步熒光強度降低，發射峰位置略有移動，這說明在該實驗條件下SiO2對色氨酸的微環境有影響，但影響較小；圖3B酪氨酸的同步熒光光譜發射峰位置和強度均沒有明顯的變化，這說明SiO2納米粒子對酪氨酸的微環境沒有影響。通過分析得出，少量的SiO2納米粒子對BSA結構中微環境的影響甚小。

圖3 BSA的同步熒光光譜圖 A：色氨酸殘基的同步熒光光譜；B：酪氨酸殘基的發射光譜Figure 3 Synchronous fluorescence spectra of BSA with SiO2 nanoparticles at 296 K. A and B:Synchronous fluorescence spectra of tryptophan and tyrosine residues.

紫外可見分光光度法可以揭示BSA結構的變化。BSA有兩個吸收峰，在210 nm處的強吸收峰主要是BSA分子二級結構的吸收峰，此處吸收峰的變化可以反映BSA二級結構變化的情況；280 nm處的弱吸收峰主要是氨基酸殘基的吸收峰，此處吸收峰的變化主要反映發色團微環境的變化[14]。固定BSA的濃度，逐漸增加SiO2的濃度，獲得BSA紫外可見吸收光譜如圖4，通過圖4，可以清晰地觀察到，隨著SiO2的加入，在210 nm和280 nm附近的吸收峰位置和強度均沒有發生變化。說明SiO2粒子對BSA的二級結構沒有產生影響。

圖4 SiO2納米粒子存在下BSA的紫外-可見光譜圖Figure 4 UV-Vis absorption spectra of BSA with SiO2 nanoparticles.

3 結論

在堿性條件下水解TEOS制備出了粒徑為220 nm的SiO2粒子，采用光譜法研究了SiO2納米粒子對BSA結構的影響。結果顯示，實驗條件下少量的SiO2納米粒子對BSA結構沒有產生影響，說明SiO2納米粒子具有很好的生物相容性。這為SiO2納米粒子的生物醫學應用提供了一定的安全保障。

[1] Li Na,Yu Zhengze,Pan Wei,et al.A near-infrared light-triggered nanocarrier with reversible DNA valves for intracellular controlled release[J].Adv. Funct. Mater,2013(23),2255-2262.

[2] Liu Rui,Zhao Xiang,Wu Tao,et al. Tunable redox-responsive hybrid nanogated ensembles [J].Journal of the American Chemical Society，2008,130(44):14418-14419.

[3] Liu Rui,Zhang Ying,Zhao Xiang,et al.pH-Responsive nanogated ensemble based on gold-capped mesoporous silica through an acid-labile acetal linker[J].Journal of the American Chemical Society,2010,132(5):1500-1501.

[4] 張瑞銳,史建國,丁露,等.多孔二氧化硅納米顆粒在藥物釋放領域中的應用進展[J].化學傳感器(ChemicalSensors),2012,33(3):11-20.

[5] 夏銀葉,李艷博,牛丕業,等.納米二氧化硅顆粒對血管內皮細胞的毒性及其凋亡誘導作用[J].吉林大學學報(JournalofJilinUniversity),2015,41(3):454-459.

[6] Burch WM. Passage of inhaled particles into the blood circulation in humans[J].Circulation, 2002,106(20):e141-e142.

[7] 高艷榮,余艷琴,賈玉巧,等.不同粒徑納米和常規微米 SiO2對大鼠肺、肝、心、睪丸組織的氧化損傷作用[J].中國療養醫學(ChineseJournalofConvalescentMedicine),2014,23(2):97-99.

[8] 王君,丁娜,張朝紅,等.光譜法研究納米二氧化硅催化超聲波照射對牛血清白蛋白的損傷[J]. 光譜學與光譜分析(SpectroscopyandSpectralAnalysis),2009,29(4):1069-1073.

[9] Cao Shuhong,Jiang Xinyu,Chen Jingwen.Effect of Zinc (II) on the interactions of bovine serum albumin withavonols bearing different number of hydroxyl substituent on B-ring[J].J Inorganic Biochem,2010,104(2):146-152.

[10] 崔媛,李艷輝,段潛.多孔納米二氧化硅球的制備及其對胰島素的擔載和釋放行為[J].硅酸鹽學報(JournaloftheChineseCeramicSociety),2013,41(2):240-244.

[11] 王士婷,陳文娟,王德平,等.Fe3O4@m-SiO2磁性納米顆粒的制備及其藥物緩釋行為[J].硅酸鹽學報(JournaloftheChineseCeramicSociety),2013,41(3):280-287.

[12] Teng Yue,Liu Rutao,Li Chao, et al. The interaction between 4-aminoantipyrine and bovine serum albumin: Multiple spectroscopic and molecular docking investigations[J].Journal of Hazardous Materials,2011,190(1-3):574-581.

[13] Mi Ran,Hu Yanjun,Fan Xiaoyang,et al. Exploring the site-selective binding of jatrorrhizine to human serum albumin: Spectroscopic and molecular docking approaches[J].Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy,2014(117):163-169.

[14] Wang Jing,Liu Rutao,Qin Pengfei.Toxic interaction between acid yellow 23 and trysin: Spectroscopic methods coupled with molecular docking[J].J. Biochem. Mol. Toxicol.,2012, 26(9):360-367.

Preparation of Silica Nanoparticles and their Effects on the Structure of Bovine Serum Albumin

LI Weihan, TIAN Zhenzhen, ZHOU Helin, WANG Yimei, XU Chang, ZHANG Huaibin*

(PharmaceuticalCollege,BinzhouMedicalUniversity,Yantai,Shandong264003，China)

The silica (SiO2) nanoparticles were prepared via hydrolyzing ethyl orthosilicate (TEOS) in an alkaline medium. The impact of silica nanoparticles on the structure of bovine serum albumin (BSA) was studied using synchronous fluorescence spectroscopy and UV-vis absorption spectroscopy. The results showed that SiO2nanoparticles do not influence significantly the structure of BSA. This also showed that the conformation and microenvironment near the chromophores of BSA don't be changed under the experimental conditions.

silica; bovine serum albumin; synchronous fluorescence spectroscopy; UV-vis absorption spectroscopy

10.3969/j.issn.2095-1035.2016.01.019

2015-09-02

2015-12-03

山東省高等學校科技計劃項目(J12LD55)；濱州醫學院大學生科技創新項目(BY2013DKCX107，BY2014DKCX092)資助

李偉瀚，男，學生。

通信作者:張懷斌，男，講師，主要從事生物分析化學研究。E-mail: zhanghuaibinhua@163.com

O654.4；X131

A

2095-1035(2016)01-0073-03