凡納濱對蝦兒茶酚—氧位—甲基轉移酶cDNA序列克隆及組織表達分析

郜衛華 田羅 黃廷華 姚敏 許巧情

摘要：利用RACE （rapid amplification of cDNA ends）技術，克隆了凡納濱對蝦兒茶酚-氧位-甲基轉移酶（catechol-O-methyltransferase，COMT）基因cDNA序列。該基因（LvCOMT）cDNA全長910 bp（GenBank登錄號JQ345478），含有666 bp的開放閱讀框（ORF），編碼221個氨基酸，理論分子量74.9 ku，等電點4.98。經軟件分析，該成熟肽有12個磷酸化的氨基酸位點，不具信號肽，推測凡納濱對蝦COMT基因可能是依賴12個可能的氨基酸發生可逆的磷酸化反應來進行調控作用。LvCOMT基因與斑節對蝦、中國明對蝦的氧位-甲基轉移酶具有高度相似性，系統進化分析表明，LvCOMT在親緣關系上更接近于哺乳動物的兒茶酚-氧位-甲基轉移酶。應用RQ-PCR分析COMT在凡納濱對蝦中的組織特異性分布，結果顯示COMT在肝胰腺組織中表達量最高，在鰓中的表達量最低。

關鍵詞：凡納濱對蝦；兒茶酚-氧位-甲基轉移酶；基因克隆；表達

中圖分類號： S917；Q786文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）02-0026-05

收稿日期：2015-03-06

基金項目：長江大學博士啟動經費（編號：8012000101122）；廣東省海洋生物技術重點實驗室開放基金（編號：GPKLMB201403）。

作者簡介：郜衛華（1977—），女，湖北襄陽人，博士，講師，主要從事水產分子營養學研究。E-mail：gwh@126.com。

通信作者：許巧情，博士，教授，主要從事水產分子生物學研究。E-mail：35507883@qq.com。

氧位-甲基轉移酶（O-methyltransferase，OMT）是一種轉甲基酶，在真菌[1]、細菌[2]、植物[3]等多種生物中普遍存在。根據甲基受體分子不同，氧位-甲基轉移酶的種類也有所不同。在動物中研究最多的2種氧位-甲基轉移酶是法呢酸-氧位-甲基轉移酶（farnesoic acid-O-methyltransferase，FAMeT）、兒茶酚-氧位-甲基轉移酶（catechol-O-methyltransferase，COMT）。COMT是1958年首先在人體中發現的一種重要代謝酶，廣泛存在于機體各種組織中，如腦、肝、腎、肺等，其主要功能是代謝具有毒性或生物活性的兒茶酚胺類物質及降解外界系統的多巴胺[4]。迄今為止，已公布甲殼動物的法呢酸-氧位-甲基轉移酶序列包括斑節對蝦（Penaeus monodon）（AY823409）、凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）（AY823408）、刀額新對蝦（Metapenaeus ensis）（AF333042）、斷溝龍蝦（Penulirus interruptus）（AF249871）、日本長額對蝦（Pandalopsis japonica）（HQ399440）、擬穴青蟹（Scylla paramamosain）（HQ587049）、中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）（GQ861517）、黃道蟹（Cancer pagurus）[5]；而甲殼動物兒茶酚-氧位-甲基轉移酶的序列僅在中國明對蝦（Fenneropenaeus chinensis）（DQ091255）和斑節對蝦（Penaeus monodon）（JN572540）中發現。據報道，水產動物的OMTs基因參與病原和細菌感染后的免疫反應[6-7]，其中COMT在動物中是否參與免疫反應尚未見報道。本研究以凡納濱對蝦為材料，通過RACE（rapid amplification of cDNA ends）技術克隆獲得凡納濱對蝦COMT基因全長，并對其進行生物信息學分析，進一步利用熒光定量PCR技術對該基因的組織特異性分布進行分析，以期為該基因免疫作用研究奠定基礎。

1材料與方法

1.1供試動物

試驗用蝦購自廣東海興農生物科技有限公司，于廣東海洋大學東海島實驗基地水泥池暫養1周。取健康凡納濱對蝦，經滅菌焦碳酸二乙酯（DEPC）水清洗后，先將其冰浴麻醉，冰浴條件下分離肝胰腺、鰓、胃、腸、心臟等5種組織，迅速裝入1.5 mL eppendorf離心管（RNase free），并立即投入液氮速凍，后轉移至-80 ℃冰箱保存備用。

1.2總RNA的提取

取凡納濱對蝦肝胰腺、鰓、胃、腸、心臟等5種組織，按照聯合基因的Unizol Reagent（GENEray biotechnology，China）操作步驟，研磨、裂解組織后提取總RNA，經1.5%瓊脂糖凝膠電泳和紫外可見分光光度計對提取的組織總RNA進行定性、定量檢測。

1.3LvCOMT cDNA全長克隆

1.3.1LvCOMT cDNA片段的獲得根據中國明對蝦COMT保守序列，應用Primer Premier5.0軟件設計正 、反向引物（LvCOMTF1/R1）克隆中間片段，本研究中所有引物（表1）均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。PCR反應體系為 20 μL，反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性1 min，57 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35個循環；72 ℃延伸10 min。用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，用PCR產物凝膠回收試劑盒（OMEGA，美國）回收擴增片段，回收后與Easy Digestion T-vector（pED-T）（SinoBio，上海市）載體連接，并轉入感受態細胞DH5α中。挑取陽性克隆菌落送往深圳華大基因公司測序，將所得LvCOMT基因cDNA中間序列于NCBI中進行blastx同源性分析。

1.3.2LvCOMT cDNA3′端和5′端的獲得根據SMARTerTM RACE cDNA Ampllication Kit（Clontech，美國）和5′RACE System for Rapid Amplification of cDNA ends（Invitrogen，美國）試劑盒操作步驟，分別擴增LvCOMT基因cDNA的3′端和5′端序列，整個過程所需引物序列見表1。PCR產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，后續的DNA回收、連接轉化、測序、同源性比對等步驟同“1.3.1”節。

1.3.3序列分析采用BioEdit軟件將中間序列、3′端序列、5′端序列拼接得到LvCOMT基因全長cDNA序列。設計正、反向引物（LvCOMTF/LvCOMTR），對該基因進行ORF開放閱讀框克隆以確保全長的正確性。該過程采用Ex Taq DNA聚合酶，PCR反應條件：95 ℃變性4 min；95 ℃變性40 s，57 ℃退火1 min；72 ℃延伸1 min，35個循環；72 ℃延伸10 min；4 ℃冰箱保存。后續的DNA回收、測序、同源性比對等步驟同“1.3.1”節，所用引物序列見表1。

1.3.4LvCOMT cDNA全長生物學信息分析通過NCBI （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/） 的blastx進行蛋白序列同源性檢索[8]；通過“http：//expasy.pku.edu.cn”網站上 ExPASy 軟件對該cDNA全長進行序列開放閱讀框搜索、蛋白質分子量、等電點、氨基酸序列的推斷等；通過“http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP” 網站上SignalP 3.0軟件預測該基因的信號肽[9]；通過Clustal W1.8軟件進行氨基酸多重序列分析，再結合MEGA 4.0軟件用鄰接法構建NJ系統樹（neighbour-joining tree）[10]。

1.3.5實時熒光定量PCR分析根據已克隆的LvCOMT基因和β-actin內參基因設計熒光定量表達的特異性正、反向引物LvCOMTF′/LvCOMTR′和β-actinF′/β-actinR′（表1）。使用Fermentas RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit（MBI，LTU）試劑盒合成cDNA第1鏈。具體步驟如下：在冰浴后PCR管中加入1 μg總RNA和1 μL Oligo-dT（15）（0.5 μg/μL），然后再加入DEPC水，配制成10 μL體系，將反應管置于PCR儀中，70 ℃預變性5 min，迅速置于冰上。變性反應結束后，再加入4 μL 5×First-strand緩沖液、2 μL 0.1 mol/L DTT、1 μL RiboLockTM Ribonuclease inhibitor、2 μL dNTP mix（10 mmol/L）后，將PCR管置于PCR儀中，37 ℃孵育5 min，再加入1 μL Superscript Ⅱ （200 U/μL），將PCR管置于PCR儀中反應，42 ℃孵育50 min，70 ℃變性10 min，4 ℃保存。實時熒光定量PCR使用SYBRPremix Ex TaqTM（TaKaRa，日本）試劑盒在ABI 7500 Real Time Thermal Cycler熒光定量PCR儀（Applied Biosystem美國應用生物系統）中進行。定量數據分析采用相對定量中的2-△△Ct法[11]；使用SPSS 13.0軟件進行顯著性分析；用Turkey法進行多重比較分析。

2結果與分析

2.1LvCOMT全長cDNA序列的克隆及分析

以凡納濱對蝦肝胰腺cDNA為模板，采用分段克隆方法和3′RACE、5′RACE法對COMT基因全長cDNA序列進行克隆，得到全部中間序列（247 bp）和3′末端（560 bp）、5′末端（447 bp）（圖1），采用BioEdit軟件去除重疊序列以及接頭序列后得到910 bp的cDNA全長序列，將獲得的凡納濱對蝦LvCOMT cDNA全長序列提交NCBI，GenBank登錄號為JQ345478。經在線軟件（http：//au.expasy.org/tools/dna.html）分析顯示，該基因具有1個起始密碼子（ATG）、1個終止密碼子（TGA）、1個長達666 bp的完整開放閱讀框，此ORF編碼221個氨基酸。該基因5′-UTR即 5′端非編碼區長99 bp，3′-UTR長145 bp。3′非編碼區存在1個mRNA不穩定基序（ATTTA），未發現典型的poly（A）+加尾信號AATAAA（圖2）。經網絡在線 （http：//web.expasy.org/compute_pi/）分析，該蛋白分子量為74.9 ku，等電點為 4.98。

2.2LvCOMT cDNA特征的分析

用“http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP”網站上的SignalP 3.0軟件在線預測該基因是否具有信號肽，發現開放閱讀框編碼的成熟蛋白沒有信號肽（圖3）。用“http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos”網站上的蛋白磷酸化位點預測該基因的磷酸化位點，得分超過0.5即為潛在的磷酸化位點[12]，結果發現該蛋白共有12個磷酸化位點，其中4個為Ser磷酸化位點，其氨基酸位點分別為6、21、76、149；3個為Thr磷酸化位點，其氨基酸位點分別為125、148、185；5個為Tyr磷酸化位點，其氨基酸位點分別為7、98、140、150、153（圖4）。

[FK（W10][TPGWH33.tif][FK）]

NCBI網站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）蛋白質保守區結果顯示，該基因有1個由204個氨基酸組成的保守區，該保守區位于第18～221個氨基酸殘基之間，該保守區屬于甲基轉移酶-3家族。除了COMT，甲基轉移酶-3家族成員還包括咖啡酰輔酶A-氧位-甲基轉移酶（caffeoyl-CoA O-methyltransferase，CCoAOMT）和細菌氧位-甲基轉移酶（O-methyltransferase，OMT）。

2.3LvCOMT基因序列比對與系統發育分析

將LvCOMT氨基酸序列與斑節對蝦、中國明對蝦、舌齒鱸

[FK（W10][TPGWH44.tif][FK）]

（Dicentrarchus labrax）、羅非魚（Oreochromis niloticus）、三文魚（Salmo salar）、虹鱒魚（Oncorhynchus mykiss）、斑馬魚（Danio rerio）的OMT氨基酸序列比較，其一致性為47%～88%，相似性為68%～95%，與斑節對蝦、中國明對蝦OMT的一致性很高，分別為88%、87%，相似性分別為95%、94%，即本研究克隆的LvCOMT基因和中國明對蝦、斑節對蝦的OMT具有較高的同源性。使用ClustalW1.83軟件對凡納濱對蝦、斑節對蝦、中國明對蝦、舌齒鱸、羅非魚、三文魚、虹鱒魚、斑馬魚的COMT氨基酸序列進行氨基酸水平的多重比較（圖5）。

用中國明對蝦（AAZ66373）OMT、斑節對蝦（AEP84098）OMT、斑節對蝦（AAX24112）FAMeT、凡納濱對蝦（AAX24111）FAMeT、刀額新對蝦（AAK28535）FAMeT、擬穴青蟹（AEE26196）FAMeT、中華絨螯蟹（ACX30003）FAMeT、斑馬魚（NP_001077312）COMT、小鼠（Mus musculus）（NP_001104533）COMT、人（Homo sapiens）（NP_001128634）COMT、擬南芥（Arabidopsis thaliana）（AAF04440）COMT、煙草（Nicotiana tabacum）（CAA52462）COMT進行系統發育分析，結果顯示凡納濱對蝦COMT基因屬于COMTs的新成員，是一種兒茶酚-氧位-甲基轉移酶（圖6）。

2.4LvCOMT基因在組織中的表達分布

熒光定量PCR分析顯示，LvCOMT基因在凡納濱對蝦的鰓、肝胰腺、胃腸道、心臟中均有表達（圖7），其表達量由高到低為肝胰腺>腸道>胃>心臟>鰓。肝胰腺中表達量最高，顯著高于其他各組織；鰓、心臟中的LvCOMT表達量最低。

[FK（W11][TPGWH77.tif；S+3mm][FK）]

3結論與討論

OMT可以催化許多不同功能和調控作用的大分子、小分子的甲基化反應，其不僅在植物、動物的生長、發育、繁殖方面具有調控作用[13-14]，而且還參與植物防御與環境因子的相互作用[15]。OMT轉甲基反應的化學機制都相同，差別在于甲基受體分子不同，對動物研究較多的2種OMT分別是FAMeT、COMT。研究表明，COMT在代謝動物大腦中的兒茶酚胺類（如去甲腎上腺素、多巴胺等）方面起重要作用[16]。在Mg2+存在時，COMT可催化S腺苷蛋氨酸的1個甲基轉移到含兒茶酚結構的底物分子上，從而形成甲基化產物[17]。本研究通過RACE技術克隆了凡納濱對蝦兒茶酚-氧位-甲基轉移酶基因（GenBank登錄號JQ345478）；該基因全長 910 bp，含有1個長達666 bp的開放閱讀框，編碼的成熟肽由221個氨基酸組成；該基因理論分子量為74 872.60 u，等電點為4.98。

COMT研究始于人體中兒茶酚-氧位-甲基轉移酶的發現[14]，繼而陸續開展了其他物種的COMT相關生物學功能研究。本研究中，經“http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi”網站上蛋白質保守區分析，結果顯示該基因有1個由204個氨基酸組成的保守區，該保守區屬于甲基轉移酶-3家族。氨基酸多重比對顯示，LvCOMT氨基酸序列與斑節對蝦、中國明對蝦、舌齒鱸、羅非魚、三文魚、虹鱒魚、斑馬魚的OMT氨基酸序列的一致性為47%～88%，相似性為68%～95%，與斑節對蝦、中國明對蝦的OMT一致性很高，分別為88%、87%，相似性分別為95%、94%，與甲殼動物十足目動物的FAMeTs序列一致性很低，即本研究克隆的LvCOMT基因和中國明對蝦、斑節對蝦的OMT具有較高同源性。系統發育分析顯示，凡納濱對蝦COMT與哺乳動物的COMTs屬于同支，屬同種兒茶酚-氧位-甲基轉移酶。

在線磷酸化位點和信號肽預測結果表明，凡納濱對蝦COMT有12個氨基酸磷酸化位點，沒有信號肽，說明凡納濱對蝦COMT基因可能是依賴12個可能的氨基酸發生可逆的磷酸化反應來進行調控作用，這與中國明對蝦調控方式一致[7]。

近年研究表明，水產動物的OMT基因在病原和細菌感染中發揮重要作用。Tsoi等用SSH技術對大馬哈魚免疫相關研究時發現，OMT基因在誘導后高度上調表達[6]。李殿香研究表明，中國明對蝦OMT基因在細菌誘導后的上調表達可能是參與了對抗細菌入侵的免疫防御反應[7]。筆者以往研究發現，COMT基因是在環境脅迫中發現的差異表達基因，其與鹽度變化之間存在某種聯系，具體機制還須要進一步研究[18]。

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