農產品中未知物分析的研究進展

游新勇，楊曙明*，趙璐瑤

農產品中未知物分析的研究進展

游新勇1,2，楊曙明1,*，趙璐瑤1

（1.中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所，農業部農產品質量安全重點實驗室，北京 100081；2.內蒙古科技大學數理與生物工程學院，內蒙古 包頭 014010）

農產品中未知物或非目標化合物的分析、篩查和確證工作是當前農產品質量與安全研究工作的熱點。本文綜述了農產品中未知物分析的研究進展和應用狀況、存在問題及今后的研究方向和發展趨勢，建立了基于高分辨精準分子質量、組學技術、生物標志物為平臺、其他分析手段等的分析模式，旨在為農產品中未知物或非目標化合物的進一步分析、篩查、監測、預警提供一定的參考，保障農產品質量與安全。

農產品；未知物；非目標化合物；分析；組學技術

農產品質量與安全作為廣大消費者最為關注的民生問題，直接關系到人們的身體健康乃至整個社會的和諧穩定[1]。隨著我國經濟和社會的持續快速發展以及人民生活水平的提高，對農產品質量與安全問題提出了越來越高的要求。盡管我國農產品質量與安全水平不斷提高，但是當前形勢依然很嚴峻，我國農產品質量與安全工作正面臨巨大挑戰[2]。

傳統的農產品質量與安全檢測技術都是針對已知目標化合物如農獸藥殘留、重金屬、有機污染物、微生物等進行檢測，可以起到很好的檢測和預警效果[3]。近年來農產品在種養殖過程中出現了新型的未知物或投入品，如克倫特羅之后又出現了萊克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林等新型藥物，另外這些新型未知添加物或投入品在農產品中的代謝途徑、代謝產物或殘留規律還不清楚，這些未知物嚴重影響著農產品質量與安全[4]。如何利用現有的科技手段建立農產品中未知物的分析、篩查和確證工作，制定標準，確保農產品質量與安全成為當前各國研究者關注的焦點。由于農產品中基質復雜，樣品來源廣泛，未知物含量變化大，因此農產品中未知物分析和檢測的難度比較大。近年來隨著高分辨率儀器分析技術的不斷發展、組學技術和生物標志物的廣泛應用，使得未知物的分析和檢測成為可能。本文對農產品中未知物分析的研究進展和應用狀況進行了綜述，建立了幾種不同的分析和篩查模式，為未知物或非目標化合物的進一步分析、篩查、監測、預警提供一定的參考。

1 基于高分辨精準分子質量為平臺的未知物分析

近年來隨著分析儀器制造技術的飛速發展，在不知道目標物背景、沒有標準品的前提下，可以對非目標化合物進行篩選、確認和定量分析。這一領域立即吸引了各國眾多的研究者，同時儀器生產者也在不斷開發新一代儀器以滿足研究需求[5]。以高分辨精準分子質量為平臺的分析主要采用飛行時間-質譜（time of flight-mass spectrometry，TOF-MS）和軌道離子阱質譜（orbital ion trap-mass spectrometry，orbitrap-MS），準分子離子峰的精確質量數的檢索匹配及多級質譜特征碎片離子信息，配合全自動篩選應用軟件實現對大量數據的高通量數據分析，成為篩查和確證未知物的有效手段[6]。

Malik等[7]綜述了液相色譜-質譜（liquid chromatographmass spectrometer，LC-MS）技術在食品安全中對農獸藥殘留、營養毒素及環境或食品加工過程中的污染物等準確定性和定量的應用，并提出其在污染物多殘留分析和非目標化合物或未知物的分離和鑒定上具有重要的發展潛力。Broecker等[8]應用液相色譜串聯四極桿飛行時間質譜（LC-TOF/MS）建立了2 500多種有毒化合物的精確質量譜從而進行系統的毒物分析，并為非目標污染物的定性提供了重要的數據庫。Pérez-Parada等[9]采用LC-MS/MS技術有效地分析和評估了Henares河水中新興的污染物，發現采用高分辨率和高靈敏度的混合質譜儀有助于擴大河水中污染物的分析范圍。Martínez Bueno等[10]采用LC-TOF/MS對河水中已知或未知藥物的精準分子質量進行篩查分析，證明了精確質量全掃描質譜特征和MS/MS譜的高采集率在目標化合物的篩選定量和非目標化合物的定性分析上具有重要的應用潛力。AB SCIEX公司的Schreiber[11]、王海鑒[12]等分別介紹了Triple 5600和Triple 4600結合化學計量學對食品樣品中污染物如農藥殘留的已知化合物或未知化合物篩查，具有準確的定量和定性分析價值。安捷倫科技有限公司的張之旭[13]在2014中國食品與農產品質量安全檢測技術國際論壇上介紹了質譜技術在農產品中農藥殘留及未知物篩查的應用。珀金埃爾默股份有限公司中國區市場總監程廣輝[14]在2014第七屆中國北京國際食品安全高峰論壇上重點介紹了非目標化合物的快速篩查技術及直接采樣飛行時間質譜（direct sample analysis-time of flight，DSA-TOF）實時、快速無需樣品制備的質譜檢測技術。

林立毅等[15]利用LC-Triple TOF儀器建立篩查農產品中未知農藥的分析方法。采用QuEChERS（quick, easy, cheap, effective, rugged and safe）法對多種農產品中殘留的農藥進行提取，PeakView軟件全智能分析，對照每個化合物的TOF-MS質量精度及同位素分布情況，與標準品譜庫對比，給出匹配度，對照化合物與標準品的保留時間，對化合物作出定性判斷。同時利用MultiQuant軟件對檢出的化合物含量結果進行定量分析，該方法滿足對農產品中農藥殘留的篩查檢測要求。王美玲等[16]采用離子阱飛行時間串聯質譜技術（LC-MS-ion trap-TOF，LC-MS-IT-TOF）對保健食品中非法添加的西地那非、他達那非和紅地那非等28 種磷酸二酯酶-5抑制劑及其類似物進行快速篩查和確證，建立了此28 種化合物的精確分子質量數和多級質譜碎片離子數據庫，為保健食品中非法添加的磷酸二酯酶-5抑制劑及其類似物的高通量篩查和定性鑒定提供了依據，根據裂解規律的歸納總結，這種篩查方法還可應用于其未知衍生物及結構類似物的分子式預測和結構推導。周煒等[17]建立了一整套利用液相色譜-四極桿/線性離子阱質譜（LC-MS/Linear-IT-MS）對獸藥中非法添加物進行篩查的方法。首先通過比較樣品與陰性對照的差異，采用Q3全掃描方式獲取靶目標化合物的母離子質荷比，再對該化合物的質譜參數、色譜分離條件等進行逐一優化，最后利用線性離子阱質譜的“多反應監測觸發增強子離子掃描”功能對靶目標化合物與相應標準物質進行譜庫匹配分析，為獸藥中非法添加物篩查及定性確證提供了一個有效的思路與方法。胡莉等[18]使用理化性質鑒別、紫外-可見分光光度計、超快速液相色譜儀-二極管陣列檢測器-離子阱-飛行時間串聯質譜儀共同對用于“染色橙”的未知著色劑進行定性分析，并用超高效液相色譜-串聯質譜（ultra performance liquid chromatograph-MS/MS，UPLC-MS/MS）進行確證。綜合實驗結果，最后定性了用于“染色橙”的未知著色劑為“橘紅2號”，其分子式為C18H16N2O3（m/z 309.193 2）。王菡[19]對加工肉制品中未知添加物質篩查與確認技術進行了研究，利用LC-TOF/MS對加工肉制品中著色劑、防腐劑、甜味劑、抗氧化劑等進行了篩查和確認，并建立了部分添加劑的標準品數據庫。趙延勝[20]利用多種儀器分析手段對食品中外源添加物進行篩查，初步構建了一套分析方法，適用于常用食品添加劑及食品中可疑化合物的檢測分析和篩查確證。

2 基于組學技術為平臺的未知物分析

后基因組時代如何解析基因組功能是生命科學研究的熱點問題，基于基因功能的復雜性和生物系統的完整性，有必要從整體層面上來理解構成生物體系的各個模塊功能。由此基因組學、轉錄組學、蛋白質組學以及代謝組學等整體性研究方法成了解析功能基因組的新的重要手段，同時也構成了系統生物學的重要內容。將其中成分的功能或有害性等表觀性狀與基因、蛋白質和代謝物建立聯系[5,21]。基因組學、轉錄組學、蛋白質組學及代謝組學等四大高通量分析組學技術為不同層次系統研究農產品質量與安全提供了技術平臺，組學分析技術近年來在農產品未知物分析過程中被廣泛采用，其中以代謝組學和轉錄組學應用最廣[22-23]。

2.1 基于代謝組學為平臺的未知物分析

代謝組學是通過考察生物體系受刺激或擾動后，相對分子質量小于1 000 的小分子代謝產物的變化或其隨時間的變化[24]。根據研究對象和目的的不同，代謝組學分析技術分為靶向代謝組學和非靶向代謝組學技術，即可以對已知的化學物質進行分析，又能對未知的化學物質進行分析[2,25]。代謝組學基于全面分析農產品成分組成的整體分析方法，因此在檢測非特定目標物方面有其他檢驗方法所沒有的優勢，因此近幾年，國內外一些學者陸續采用代謝組學技術對農產品中非目標化合物或未知物進行了研究[26-29]。

de Clercq等[30]報道了“應用HPLC-高分質譜（high resolution mass spectrometer，HRMS）進行口服潑尼松龍的黑白花奶牛糖皮質激素的代謝組學研究”。他們使用了HPLC-Orbitrap和HPLC-TOF-MS/MS對口服藥物組及對照組奶牛、犢牛的尿液和糞便進行比較研究，發現了數種潑尼松龍的特有代謝產物，例如20β-二氫潑尼松龍和20α-二氫潑尼松龍，這些發現有助于選擇到區別于內源性糖皮質激素的恰當標志物，證實動物曾使用了非法添加劑。Javier等[31]報道了使用組合式質譜儀進行恩諾沙星在肉雞的代謝組學研究，以尋找新的代謝產物。治療劑量的恩諾沙星通過飼料連續喂雞4 d，肌肉、血液、肝臟等組織取樣，與對照組比較后提取藥物及其代謝物峰。取出目標物后剩余為可能的未知代謝物峰。通過一級質譜的精準分子質量和天然同位素豐度擬合，初步篩選新的恩諾沙星代謝產物。然后，通過二級質譜峰擬合，最終確認了13 種新的恩諾沙星代謝產物。Tengstrand等[3]利用代謝組學技術，使用HPLC-TOF/MS進行食品中非目標污染物的分析。他們在3 種新鮮橙汁分別添加了0.4～100 μg/g水平的26 種化學污染物，通過色譜峰增益降低本底樣品噪聲，利用主成分分析建模，辨別含有污染物的果汁。所有含有污染物果汁均被辨別出來，同時僅出現2 個假陽性結果。Courant等[32]利用LC-HRMS，結合非靶向代謝組學分析方法，建立了根據小牛尿液代謝物的改變來監測濫用β2-受體激動劑克倫特羅的方法，結合主成分分析和正交偏最小二乘法判別分析進行數據分析，發現了兩個潛在的生物標志物，但能否作為克倫特羅所特有的生物標志物還有待進一步確證。

李哲[33]研究了基于代謝組學的微囊藻毒素-LR毒性的作用機制，論證代謝組學應用于農產品安全監測、評估的可能性。研究結果發現，尿液中羥基苯乙酸、色氨酸和馬尿酸的含量降低，磷脂酰乙醇胺、血栓烷B2、膽酸的含量升高，這些物質的變化均與微囊藻毒素-LR對機體造成的損傷有關。論證了代謝組學具有非侵入性、無目標性和靈敏性的特點，對非目標化合物的代謝評估具有重要意義。李勇[34]建立了雞體內獸藥喹烯酮的代謝組學方法，揭示了獸藥的殘留機制，發現新的代謝標識物。結果表明代謝組學分析能夠很好地反映出用藥后動物體內外源性代謝物的劑量效應和時間效應，還能夠描述出內源性代謝物表型的改變，為獸藥殘留及監測提供基礎。許梅燕[35]研究了添加色素在肉雞及其產品中代謝組學的分析，研究發現色素在動物體內引起的內源性代謝物變化并找到一定的生物標記物，從而識別天然及人工合成色素對內源性代謝的影響，實現禽產品中色素殘留的溯源分析，為有效評價禽產品中色素的安全性提供科學依據。盧春鳳[36]對內分泌干擾物四氯二苯并二噁英與多氯聯苯類聯合暴露復合效應的代謝組學研究，探討復合效應作用模式及作用機制，尋找復合效應的候選生物標志物，為未知污染物的篩查提供了基礎數據。

2.2 基于轉錄組學為平臺的未知物分析

轉錄組學是從RNA水平研究基因表達的情況，研究生物細胞中轉錄組的發生和變化規律[22]。應用轉錄組學技術對農產品中未知物或非目標化合物對機體在DNA水平、mRNA水平上的響應研究，通過生物芯片技術、mRNA差異顯示技術和基因表達譜分析等，為未知物或非目標化合物分析、篩查提供了可能。Sato等[37]研究了β2-受體激動劑克倫特羅對大鼠骨骼肌和左心室肌的β1-和β2-受體mRNA的表達，通過實時聚合酶鏈式反應（real time-polymerase chain reaction，real time-PCR）分析了鹽酸克倫特羅對快肌纖維豐富的趾長伸肌（extensor digitorum longus，EDL）和慢肌纖維豐富的比目魚肌（soleus，SOL）和左心室肌（left ventricle，LV）的β1-和β2-受體mRNA的表達，將成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠隨機分為鹽酸克倫特羅給藥組和對照組，給藥的劑量是1 mg/（kg·d），給藥10 d。結果表明鹽酸克倫特羅給藥組顯著增加了EDL的質量、RNA濃度和總RNA含量，對SOL和LV的質量沒有影響；但是鹽酸克倫特羅能顯著降低LV的β1-受體mRNA的表達，同時降低了EDL和LV的β2-受體mRNA的表達，對SOL肌的β2-受體mRNA的表達無影響，因此鹽酸克倫特羅影響β1-和β2-受體mRNA的表達和肌肉生長取決于肌纖維類型。Riedmaier等[38]研究認為RNA測序技術在打擊濫用合成代謝劑中是一種有效的篩查工具。合成代謝劑的使用會引起動物分子水平上的生理變化，通過對基因表達響應的定量可以成為新的篩查方法，研究表明RNA測序篩選候選生物標志物在檢測合成代謝劑的濫用上具有重要的潛力。Riedmaier等[39]同時研究了打擊非法生長促進劑應用時監測RNA表達的變化，介紹了基因表達譜分析技術，總結了以轉錄組分析和識別牛中生長促進劑使用后潛在的基因表達生物標志物，這對于動物性食品中生長促進劑的篩查分析具有重要的意義。

張廣遠[40]建立了轉基因食品基因芯片檢測及鑒定方法，以商業化種植的轉基因作物為對象，應用寡核苷酸基因芯片技術建立了7 種轉化事件特異性檢測方法，為未知轉基因食品的篩查提供了依據。高興等[41]開展了多種食源性致病菌的基因芯片檢測技術，初步建立了基于隨機引物PCR的基因芯片技術進行多種食源性致病菌檢測的方法，為病原細菌高通量篩查檢測提供了一種新的思路。穆小婷等[42]綜述了生物芯片在乳品檢測中的應用，對乳品中非目標化合物的篩查具有重要的作用。翟淑平等[43]應用蛋白芯片技術建立了動物組織中重要獸藥磺胺二甲基嘧啶、恩諾沙星、鹽酸克倫特羅和鏈霉素的高通量篩選方法。

2.3 基于蛋白質組學為平臺的未知物分析

張增榮等[44]探討了蛋白質組學技術在畜禽肉品質研究中的應用，為畜禽肉制品品質的非目標化合物的表征提供了可能。吳暉等[45]分析了蛋白質組學技術在食品微生物安全評估與檢測中的應用，探討利用蛋白質組學的方法研究微生物在外界環境變化時蛋白質組上的響應以及與食品安全相關的生物膜的研究進展等，實現了食品中的病源微生物以及微生物毒素的快速分析和篩查。

3 基于生物標志物為平臺的未知物分析

生物標志物（biomarker）是指能反映生物體與環境因子相互作用引起的生理、生化、免疫和遺傳等多方面分子水平改變的物質[46]。它可以測定污染物效應的生理和生化指標，也可以通過組學技術測定污染物在生物體轉錄或代謝物的特征指標，通過對生物標志物的發現和監測，可以及時診斷和監控當前生物學過程[5]。各國學者在農產品安全領域也開展了不同污染物的生物標志物研究，由生物標志物的分析來推測農產品中是否或曾經存在一些違禁污染物或非目標污染物。

Regal等[47]利用液相色譜-高分辨質譜儀，應用代謝組學的方法建立了兩個模型，對牛的血清進行分析，以鑒定牛是否使用了雌二醇或孕酮，實驗結果發現雌二醇或孕酮的潛在生物標志物為準確判斷牛體內是否含有雌二醇或孕酮提供了理論依據。德國慕尼黑工業大學的Pfaffl[48]和Riedmaier[49]等綜述了轉錄組的生物標志物，當組織、器官或細胞受外部環境影響時，在分子或細胞水平上會有基因表達水平的變化，從而能夠指示或描述藥物或環境刺激后的生理或病理狀態，在興奮劑和激素生物學中已成功應用特征基因和microRNA的表達模式，尤其是RT-qPCR數據分析方法在發現生物標志物中的應用，使得生物標志物的研究更加活躍。趙焱坤[50]研究了微量有機磷農藥脅迫下家蠶生物標志物的響應，結果表明家蠶對有機磷農藥是很敏感的，即使受到微量質量濃度（0.05 mg/L）的脅迫，其生理方面都會發生顯著變化，這些變化部分可以作為候選的環境農藥殘留檢測的生物標志物。陳慧男等[51]綜述了分子標志物在植物重金屬污染中的應用，分別探討了金屬結合蛋白、抗氧化酶防御系統、ATP酶、DNA損傷等各種生物分子作為標志物監測及預警植物受重金屬污染的程度。王奇[52]研究了珠江三角洲典型養殖區磺胺類抗生素的監測分析及其生物標記物，結果發現水體中魚類肝臟組織中谷胱甘肽轉移酶、丙二醛含量可以作為專一性較高的生物標志物，結合其他指標共同指示磺胺類藥物在環境中的殘留。

4 其他分析手段

近年新興起來的微流控芯片-質譜檢測技術等也為農產品中的未知物分析提供了一種全新的思路。張潔等[53]設計了一個微流控芯片上的體外肝模型來研究前體藥物代謝，并同時使用質譜檢測前體藥物的代謝產物。若將這種微流控芯片上的細胞培養技術應用在農產品上，檢測某一物質對人體或動物是否有害時，將其直接作用于細胞，模擬體內實驗，可以測定其代謝產物和對細胞造成的影響，這樣就可以減少動物實驗，更省時簡便。另外借助色譜分離原理，可以設計一種微流控芯片：將混合物注入，按種類不同分流入不同的通道，再串聯質譜進行定性分析，減輕分離大量化合物對色譜柱的損害，不同通道分別進質譜，可以篩查更多物質。

5 結 語

由于農產品基質復雜，樣品來源廣泛，篩查對象千差萬別，未知物含量變化大，因此在農產品未知物或非目標化合物分析中存在的問題也比較多，大體可歸納以下幾個方面：非目標化合物的定性和結構解析；高通量、高分辨率儀器設備和軟件的開發整合；基于組學技術數據庫的構建；生物標志物的篩選和確認。但可以肯定的是在今后農產品質量與安全的研究工作中，各種平臺基礎上的未知物分析手段將會快速發展，這些問題將成為今后研究的重點，同時在此基礎上發展多維儀器設備技術的聯用、未知物快速篩查技術等也將成為今后的發展方向。

農產品質量安全是一個全球關注的論題，同時也將是一個長久的議題，這對保障消費者健康和生命安全至關重要，然而生產者追求最大利潤的天性難以完全被法律和良心鎖住，造成農產品中不斷出現新型未知添加物，因此農產品中未知物或非目標化合物的分析篩查工作成為不同國家、不同層次的眾多研究者關注的焦點[5]。相信隨著科技的不斷進步和發展，在農產品未知物或非目標化合物分析中會逐步建立成熟的分析篩查模式，完善農產品中不確定因子的監測和評估，有效監控農產品質量安全，保障消費者權益和生命健康。

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Advances in Analysis of Unknown Components in Agricultural Products

YOU Xinyong1,2, YANG Shuming1,*, ZHAO Luyao1
(1. Key Laboratory of Agri-food Safety and Quality, Ministry of Agriculture, Institute of Quality Standard and Testing Technology for Agro-Products, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China; 2. School of Mathematics, Physics and Biological Engineering, Inner Mongolia University of Science and Technology, Baotou 014010, China)

The screening and confirmation analysis of unknown or non-target compounds in agricultural products are the current focus of studies on agricultural product quality and safety. This paper reviews the progress made in the development and application of analytical techniques such as high-resolution accurate molecular mass spectrometry, omics technology and biomarker-based techniques for the identification of unknown components in agricultural products. Existing problems are pointed out and future development directions are also proposed. The aim of this paper is to provide a reference for further analysis, screening, monitoring, and early warning of unknown or non-target compounds in agricultural products to ensure the quality and safety of agricultural products.

agricultural products; unknown; non-target compounds; analysis; omics technology

10.7506/spkx1002-6630-201601045

TS201.6

A

1002-6630（2016）01-0263-06

游新勇, 楊曙明, 趙璐瑤. 農產品中未知物分析的研究進展[J]. 食品科學, 2016, 37(1): 263-268. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201601045. http://www.spkx.net.cn

YOU Xinyong, YANG Shuming, ZHAO Luyao. Advances in analysis of unknown components in agricultural products[J]. Food Science, 2016, 37(1): 263-268. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201601045. http://www.spkx.net.cn

2015-01-26

公益性行業（農業）科研專項（201203023）；內蒙古科技大學創新基金-科研啟動項目（2014QDL009）

游新勇（1982—），男，博士研究生，研究方向為農產品質量安全檢測及評價。E-mail：xinyong8206@163.com

*通信作者：楊曙明（1963—），男，研究員，博士，研究方向為畜產品質量與安全。E-mail：yangshumingcaas@sina.com