新一代基因組編輯技術
——NgAgo-gDNA

楊 潔 曹玉錦

(山東省棗莊市薛城奚仲中學 277000)(中國科學院青島生物能源與過程研究所 266101)

2016年5月2日，生物學領域頂尖刊物《自然-生物技術》發表了我國河北科技大學韓春雨等的研究成果《DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute》[1]，該論文提出一種新的基因組編輯技術NgAgo-gDNA。

1 什么是基因組編輯技術

基因組編輯技術(genome editing)是指對基因組進行定點修飾的遺傳操作技術[2]。利用該技術，可以精確地定位到基因組的某一位點上，實現對特定DNA片段的敲除、插入等操作。該技術通過在特定的靶向序列處引入斷裂的DNA雙鏈，繼而利用細胞自身的修復機制完成修復，從而達成修改并編輯原有的基因組的目的。與傳統的同源重組技術和胚胎干細胞技術相比，基因組編輯技術具有快速、操作便捷、成本較低等優勢，為基因治療、生物遺傳改造等領域開辟了新的途徑。

基因組編輯技術迄今為止僅有20年左右的歷史，但在近十年取得突破性進展，目前已提出的基因組編輯策略包括ZFN技術、TALEN技術、CRISPR/Cas9技術以及本文著重介紹的NgAgo-gDNA技術。

2 新一代基因組編輯技術——NgAgo-gDNA

NgAgo-gDNA是Natronobacterium gregoryi Argonaute - guide DNA的簡稱，Natronobacterium gregoryi是格氏嗜鹽堿桿菌；Argonaute(Ago)是一種核酸內切酶；gDNA 即向導DNA。2004年，荷蘭學者發現來自嗜熱菌的Ago可以有效地利用5′磷酸化的單鏈DNA作為gDNA，對基因組進行定點切割造成其雙鏈斷裂[2](但該酶需要在>65°C的條件下才具有活性，限制了其在生物體中應用的可能性)。韓春雨課題組在此基礎上，通過數據庫比對，找到了來自格氏嗜鹽堿桿菌的Ago(NgAgo)，該蛋白在生理條件下即具有很好的酶切活性，可以在多種哺乳動物細胞中實現gDNA介導的基因組的切割(圖1)，并且能夠實現在基因組中插入目的DNA片段的能力，是一種高效快捷的基因組編輯工具[1]。

根據韓春雨課題組的研究結果，NgAgo-gDNA與CRISPR/Cas9技術相比具有以下特點：①向導設計制作簡便：gDNA設計方便，可以像合成PCR引物一樣由公司合成，輸送方式直接，直接轉染細胞：②編輯對象所受限制小：Cas9需要與基因組上19個堿基配對，并要求在這組堿基后緊鄰一個特定的PAM序列，一定程度上限制了靶位點的選擇范圍，而NgAgo-gDNA技術中靶位點的選擇則不受PAM序列的限制，幾乎能編輯基因組內任何位置；③編輯精準度更高：與NgAgo結合的gDNA長度為24個堿基，這比與Cas9結合的19個堿基的gRNA要長5個堿基，理論上其精確性可以提高45倍；NgAgo-gDNA系統對gDNA靶序列錯配容忍度很低；同時，向導核酸是DNA而非RNA，避免了RNA形成復雜的二級結構而帶來的失效或者脫靶效應。與CRISPR/Cas9技術相比，目前NgAgo-gDNA的劣勢在于：①無法使用質粒或慢性病毒載體輸送gDNA；②gDNA不能再改造，而gRNA可以連接一段RNA不影響功能。

圖1 NgAgo-gDNA技術原理示意圖

3 NgAgo-gDNA技術的啟示

NgAgo-gDNA是我國學者首創的尖端生物技術，被譽為第四代基因組編輯技術，打破了國外基因組編輯技術的專利壟斷。但該技術還需要后續工作進行驗證和進一步的改進。