基于高光譜圖像的雞種蛋孵化早期胚胎性別鑒定

潘磊慶，張　偉，于敏莉，孫　曄，顧欣哲，馬　龍，李紫君，胡鵬程，屠　康※（.南京農業大學食品科技學院，南京0095；.南京曉莊學院食品科學學院，南京7；.南京農業大學動物科技學院，南京0095）

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基于高光譜圖像的雞種蛋孵化早期胚胎性別鑒定

潘磊慶1，張偉2，于敏莉3，孫曄1，顧欣哲1，馬龍1，李紫君1，胡鵬程1，屠康1※
（1.南京農業大學食品科技學院，南京210095；2.南京曉莊學院食品科學學院，南京211171；3.南京農業大學動物科技學院，南京210095）

摘要：為了對雞種蛋孵化早期胚胎進行性別鑒定，構建了高光譜圖像采集系統，在400～1 000 nm范圍內獲取94枚種蛋孵化0～12 d的高光譜透射圖像。分別在胚胎的圓頭、中間、尖頭3個部位選擇感興趣區域（region of interest，ROI），獲取400～1 000 nm波段的響應信號，構建了支持向量機（support vector machine，SVM）、偏最小二乘判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLSDA）和人工神經網絡（artificial neural network，ANN）的雞胚胎性別鑒定模型，并比較了不同孵化時間雌雄胚胎的鑒別準確率。試驗結果表明，SVM模型、PLSDA模型和ANN模型均對孵化第10天種蛋中間部位檢測效果最好。隨后通過分析第10天種蛋中間部位光譜響應的差異，選取600～900 nm的光譜值構建胚胎性別鑒定模型，結果發現，3種模型的判別準確率均有上升，SVM模型和PLSDA模型預測集樣本判別準確率均為75.00%，ANN模型預測集樣本判別準確率達到82.86%。其中，ANN構建的種蛋孵化胚胎性別檢測模型的整體效果優于SVM模型和PLSDA模型。結果表明高光譜圖像技術在檢測雞種蛋孵化早期胚胎性別方面有一定效果，但種蛋蛋殼的個體差異會對鑒定準確率造成一定影響。

關鍵詞：光譜分析；圖像處理；無損檢測；高光譜圖像；雞種蛋；孵化早期；胚胎；性別鑒定

潘磊慶，張偉，于敏莉，孫曄，顧欣哲，馬龍，李紫君，胡鵬程，屠康.基于高光譜圖像的雞種蛋孵化早期胚胎性別鑒定[J].農業工程學報，2016，32（01）：181-186.doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2016.01.025 http://www.tcsae.org Pan Leiqing, Zhang Wei, Yu minli, Sun Ye, Gu Xinzhe,Ma Long, Li Zijun, Hu Pengcheng, Tu Kang.Gender determination of early chicken hatching eggs embryos by hyperspectral imaging [J].Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering （Transactions of the CSAE）, 2016, 32（01）: 181-186.（in Chinese with English abstract）doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2016.01.025 http://www.tcsae.org

0　引言

家禽繁育中，雛禽的性別與經濟效益密切相關。如在雞蛋生產行業，母雞的需求比例遠高于公雞，而在肉雞行業，由于公雞對飼料的利用率比母雞高，生命力強，生長速度快，需求量更大[1]。但雞蛋的孵化過程大約需要21 d，是一個耗時、耗能的過程。如果能在雞種蛋孵化早期，檢測胚胎性別，根據市場需求，控制孵化雞雛的性別比例，從而大幅度節約生產成本，提高企業生產效率。種蛋性別鑒別傳統方法是通過種蛋的外觀和物理性質，但這種方法存在主觀性強、準確率較低的缺點。另一方面，雖然在孵化后期16～18齡及出雛后雞性別的傳統鑒定方法非常有效，但是對這些雞胚的處理是有悖于社會倫理、殘忍的一件事情。而在孵化結束前盡早鑒別出雞胚的性別并進行適當處理，能夠兼顧實際生產和社會倫理的要求。因此，開放一種快速準確的識別孵化早期胚胎性別的方法，對整個家禽行業具有重要意義。

在已有的報道中，形狀特征和內容物變化是家禽早期性別鑒定的主要方式。前者包括種蛋、胚線、性腺形態等。王家培等[2]利用蛋形指數對黔東南小香雞種蛋進行性別鑒定初步研究，發現蛋形指數與性別有較為密切的相關性。唐劍林等[3]對孵化3 d的胚胎光照，發現雄胚的主血管明顯且較粗，呈均勻分布；雌胚血管纖細，粗細均勻，分支較多，呈不規則狀，從而對種蛋性別進行區分。后者如分子生物學方法、激素方法。Griffiths等[4]描述了利用PCR技術鑒定5～7 d雞胚性別的方法。另外，雌激素是用來雞胚性別鑒定的有效指標。美國Embrex公司已有兩項專利（專利號分別為6506570和6510811）采用此方法。Steiner[5]等利用近紅外成像系統，對從種蛋中取出的未孵化胚胎進行分析，結果表明近紅外成像系統具有鑒別為孵化種蛋胚胎的潛在能力。雖然以上的研究有的結果很好，但是存在的缺陷也很明顯，如PCR、DNA和紅外光譜法方法操作步驟多，比較復雜，不宜在工業化生產實踐中使用，而且都需要破壞種蛋，影響胚胎發育；而形態學的方法僅關注胚胎發育的外在形態，獲取種蛋發育信息不全面，造成結果差異很大。從已有的研究也可以看出，胚胎性別鑒定的方法還是基于種蛋胚胎在發育過程中的胚相、理化方面的信息差異，而高光譜圖像技術能夠很好地反映胚胎發育的這些信息。

高光譜成像技術是集成了光學光譜和傳統的成像技術的發明。應用高光譜成像系統既能提供樣本的光譜信息又能提供空間信息這一優勢，可以對農產品的質量進行快速準確評價。該系統可以通過收集全光譜信息結合多變量分析，檢測樣本的化學成分組成和濃度分布，彌補了單一光譜技術或成像技術的不足。該技術已經廣泛應用于肉類、果蔬類品質等方面的檢測[6-8]。因此，利用高光譜圖像獲取胚胎在孵化過程的信息，建立胚胎性別快速無損鑒別方法具有較大的研究價值。由于種蛋在孵化過程中，生理代謝和物質互相轉化，蛋殼以及內部物質不斷變化，同時伴隨著一系列物理和化學性質的改變。因此，種蛋性別不同會造成其光譜值存在一定差別，通過一定的光譜分析方法有可能實現胚胎早期性別鑒別。

1　材料與方法

1.1試驗材料

材料為白殼貴妃雞種蛋，購于浙江省瑞安市一家珍禽種養場，共94枚。雞種蛋在35℃、0.1%新潔爾滅溶液中浸泡5 min進行消毒處理，分別編號，晾干后放入孵化箱中，其中，孵化溫度和相對濕度分比為37.8℃和65%。每2 d采集高光譜圖像，連續檢測12 d。為了更準確的判定胚胎性別，種蛋孵化到第16天，打開種蛋進行破壞性檢測，人工判斷胚胎性別。胚胎發育至第8天后，可以通過睪丸和卵巢形態進行性別區分，越到后期越容易實現人工判定。因為二者的差異在于：雌性胚胎右側卵巢退化，使得卵巢兩側發育不平衡；而雄性胚胎兩側的睪丸發育對稱[9]，可通過解剖后肉眼觀察到雄性睪丸和雌性卵巢的形態變化來區分種蛋性別，如圖1所示。本研究嚴格遵守實驗動物護理和使用協議，該協議得到了南京農業大學動物實驗倫理委員會的許可。本研究不涉及瀕危和受保護物種，并盡可能減少動物的痛苦。

圖1　雞胚性別形態圖Fig.1 Chicken embryo ovarian morphology diagram

1.2高光譜透射圖像采集系統

高光譜成像系統檢查雞種蛋胚胎性別裝置如圖2所示。高光譜常用光源照射方式主要分為反射、半透射、透射3種。反射方式主要適用于檢測樣品表面缺陷，以及光穿透性較低的樣品。透射主要適用于檢測樣品內部缺陷，以及光穿透性較高的樣品[10-11]。半透射介于兩者之間。本研究中采用透射方式。本試驗中對種蛋胚胎采取橫向放置采集圖像。

試驗中使用的高光譜成像系統由硬件和圖像采集軟件構成，硬件主要由相機（Imperx, ICL-B1620，有效波段范圍為400～1 000 nm，光譜分辨率為2.8 nm）、光譜儀（Specim，ImSpector V10E）、焦距可變鏡頭、傳送單元、可調光源（150 W鹵素鎢燈）和電腦構成。檢測物體放置在電動平臺上，通過控制平臺設置合適的傳送速度，使檢測樣品被光譜成像設備以線掃描的方式，記錄空間和光譜信息。

圖2　高光譜成像系統雞胚胎性別鑒定的裝置Fig.2 Schematic diagram of hyperspectral imaging system

1.3高光譜圖像采集與校正

本文采用的高光譜成像系統圖像采集軟件Spectral Image（isuzuoptics, tw, China）由臺灣五鈴光學股份有限公司提供。在高光譜圖像采集前，相機曝光時間、光強、焦距、圖像存儲大小和傳送裝置的速度等參數需要優化，以確保圖像的質量[12]。經過預試驗，最終確定曝光時間55 ms，采集速度1.6 mm/s，圖像分辨率440×804。為了消除相機暗電流等噪聲的影響，獲取的原始圖像（R0）需要進行黑白校正[13]。獲取透射標準白色校正板（反射率99%）得到全白的標定圖像W，蓋上鏡頭蓋，采集全黑的圖像D，根據下式（1）得到校正的相對圖像Rc：

式中R0為原始高光譜透射圖像；D為全黑的標定圖像；W為全白的標定圖像；Rc為標定后高光譜透射圖像[14]。

1.4數據處理和建模

本論文中運用ENVI軟件對高光譜數據進行初步特征參數提取，包括光譜特征和圖像特征。而后，提取的特征帶入Matlab中進行圖像處理和建模分析。本研究中，選取ROI（region of interest）區域大小為25×25像素點。為了更好的研究雞胚胎不同部位對性別鑒定準確率的影響，分別在雞胚胎橫軸等間隔采集感興趣區域，包含雞胚胎的圓頭、中間、尖頭部位，具體如圖3所示。

試驗中，模型訓練集樣本62個，預測集32個。為充分比較不同的建模方法對預測性能的影響，運用了支持向量機（support vector machine，SVM）[15]、偏最小二乘判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLSDA）[16]和人工神經網絡（artificial neural network，ANN）[17]對數據進行建模分析。高光譜系統判斷結果的準確率通過與人工判別相比較得出。

圖3　雞胚胎ROI區域位置選擇Fig.3 ROI location in chicken embryo

2　結果與分析

2.1雞胚胎不同孵化時間的光譜曲線變化情況

圖4代表了不同孵化時間的雞胚胎中間部位ROI區域的400～1 000 nm平均光譜曲線，可以看出光譜曲線之間存在明顯的差異，說明胚胎孵化時間不同，光譜響應值也不同。反映了孵化過程中蛋殼結構、內部物質轉化影響著光譜值的變化。隨著孵化時間的延長，種蛋胚胎從種蛋圓頭開始發育，逐漸向尖頭延伸，雞胚胎變的不透明，透射光譜值越來越低。

圖4　不同孵化時間種蛋中間部位透射光譜曲線Fig.4 Transmittance spectral curves of middle part of eggs atdifferent hatching time

2.2不同性別雞胚胎發育形態變化

圖5為雌雄胚胎在不同孵化時間的高光譜圖像。可以發現二者在圖像方面沒有明顯的區別，無法應用圖像特征進行性別鑒定。因此，后續研究通過對光譜數據的分析對種蛋胚胎進行性別鑒定。

圖5　不同性別種蛋胚胎發育形態圖Fig.5 Hatching eggs embryos diagram of different gender

2.3基于全波段光譜曲線和不同模型對種蛋胚胎性別鑒定

將全波段提取的ROI原始平均光譜數據作為輸入變量，將胚胎性別作為輸出變量，建立性別鑒定預測模型。不同部位光譜數據構建的SVM模型、PLSDA模型和ANN模型建模集和預測集判別準確率分別如圖6a、6b和6c所示。其中，SVM模型參數為：核函數均為徑向基函數，最優參數gamma值均為0.031 6，cost值均為100。構建的神經網絡模型參數為：輸入層為420，隱藏層數為1，隱藏層節點數為14，隱藏層激活函數為雙曲正切；輸出層個數為2，即雄性與雌性，輸出層激活函數Softmax。

圖6a中表明以種蛋胚胎圓頭部位提取的ROI光譜數據建立的SVM模型在第8天準確率最高，建模集和預測集準確率分別為83.87%和65.63%。建立的PLSDA模型在第6天準確率最高，建模集和預測集準確率分別為69.35%和62.5%。建立的ANN模型在第12天準確率最高，建模集和預測集準確率分別為75.30%和77.00%。SVM模型準確率與PLSDA模型準確率差別不大，ANN構建的種蛋胚胎性別的檢測模型整體效果明顯優于SVM模型和PLSDA模型。

圖6b表明以種蛋胚胎中間部位提取的ROI光譜數據建立的SVM模型在第10天準確率最高，建模集和預測集判別準確率分別為90.32%和71.88%。建立的PLSDA模型在第10天準確率最高，建模集和預測集判別準確率分別為88.71%和71.88%。建立的ANN模型同樣在第10天準確率最高，建模集和預測集判別準確率分別為75.00% 和80.00%。SVM模型準確率與PLSDA模型準確率差別不大，ANN構建的種蛋胚胎性別的檢測模型整體效果明顯優于SVM模型和PLSDA模型。

圖6　不同ROI區域構建的SVM、PLSDA、ANN模型判別準確率Fig.6 Gender detection accuracybased on SVM, PLSDA and ANN modelsby different ROI regions

圖6c中可以發現以種蛋胚胎尖頭部位提取的ROI光譜數據建立的SVM模型在第10天準確率最高，建模集和預測集準確率分別為69.35%和62.5%。建立的PLSDA模型同樣在第10天準確率最高，建模集和預測集準確率分別為69.35%和65.63%。建立的ANN模型在第2天準確率最高，建模集和預測集準確率分別為79.70%和73.30%。SVM模型準確率與PLSDA模型準確率差別不大，ANN構建的種蛋胚胎性別的檢測模型效果明顯優于SVM模型和PLSDA模型。

因此，從上述結果可以發現，種蛋胚胎中間部位性別鑒定準確率優于圓頭部位和尖頭部位，而且孵化到第10天胚胎的性別更容易區分。原因可能是胚胎發育到第10天時，發育的睪丸和卵巢形態上差別已經比較大了，雄激素睪酮等性激素的分泌也有了較大差異[9]，也會造成雌雄胚胎光譜的差異。而選擇中間部位減少了種蛋尺寸、光照等因素對光譜的影響。通過對數據的比較分析發現，以種蛋孵化第10天中間部位提取的ROI光譜數據建立模型對種蛋胚胎性別進行預測的準確率最高。鑒別結果如表1所示。

表1　基于孵化10 d種蛋中間部位400～1000 nm響應光譜對種蛋性別鑒定模型判別結果Table 1 Gender detection resultsby using spectral response of 400～1000 nm inmiddle part of hatching egg on day 10 during incubation

為了進一步分析雌雄胚胎在孵化第10天中間部位的光譜差異，提高性別鑒定的準確率，需要對光譜的響應差異做重點分析。圖7為第10天所有種蛋孵化雌雄胚胎中間部分的ROI光譜平均值。可以看出，在400～600 nm和 900～1 000 nm范圍內雌雄胚胎光譜響應差異很小，屬于干擾信息，對雌雄胚胎的性別鑒定無法提供幫助。而在600～900 nm范圍內，二者有較明顯的差異，雄性胚胎的透射光譜值低于雌性種蛋，存在一定規律，有助于雌雄胚胎的性別。利用600～900 nm范圍內光譜響應值構建性別鑒定模型，結果如表2所示。其中，SVM模型參數為：核函數均為徑向基函數，最優參數gamma值均為0.031 6，cost值均為為100。構建的神經網絡模型參數為：輸入層為207，隱藏層數為1，隱藏層節點數為14，隱藏層激活函數為雙曲正切；輸出層個數為2，即雄性與雌性，輸出層激活函數Softmax。SVM模型和PLSDA模型預測集判別準確率均從71.88%上升到75.00%，準確率提高了3.12%。ANN模型預測集判別準確率從80.00%上升到82.86%，準確率提高了2.86%，證明去除干擾信息對模型準確率的提高有一定效果。種蛋發育不同階段，存在著不同光譜和形態的特征。種蛋中間部位處于兩者之間，更靠近胚胎發育位置，隨著孵化時間的延長透光性逐漸下降，光譜數據變化趨勢更加穩定，因此更適合種蛋性別鑒定。

表2　孵化第10天雌雄胚胎中間區域600～900 nm響應光譜的種蛋性別鑒定模型判別結果Table 2 Gender detection resultsbased on spectral region of 600～900 nm of hatching egg on day 10

圖7　第10天雌雄種蛋中間區域平均光譜曲線Fig.7 10th day average spectral curvesof male and female eggs （Middle part of egg）

3　結論

1）本文根據種蛋孵化特性，構建了種蛋胚胎性別鑒定的高光譜采集系統，確定了系統采集參數和方法，采用不同孵化時間和種蛋胚胎不同部位光譜數據，構建基于偏最小二乘判別分析（PLSDA）、支持向量機（SVM）和人工神經網絡（ANN）的雌雄胚胎性別鑒定的模型，根據判別準確率的差異，確定了在孵化胚胎第10天中間部位的光譜信息最適合用于胚胎性別的鑒定。

2）根據第10天雌雄胚胎中間部位的平均光譜曲線差異，選取600～900 nm波段光譜數據重新建立性別鑒定的SVM、PLSDA和ANN模型，通過模型準確率比較，發現ANN模型準確率最高，建模集和預測集準確率分別為88.14%和82.86%，且比全波段構建的模型準確率提高2.86%。

3）本文的研究表明，高光譜圖像對種蛋性別的鑒定有一定的效果。但是種蛋形狀、蛋殼厚度、胚胎發育變化和放置方向等問題都會對透射光譜值造成一定影響，降低了種蛋孵化性別鑒定的準確率。在以后的研究中，需要使用更多的樣本數量，選擇不同的處理方法，盡可能消除個體差異對光譜數據的影響；進一步明確種蛋各個發育階段雌雄胚胎的理化和生化差異，選擇更為準確的高光譜參數提高鑒定的精度。

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Gender determination of early chicken hatching eggs embryos by hyperspectral imaging

Pan Leiqing1, Zhang Wei2, Yu minli3, Sun Ye1, Gu Xinzhe1,Ma Long1, Li Zijun1, Hu Pengcheng1, Tu Kang1※
（1.Collegeof Food Scienceand Technology,Nanjing Agricultural University,Nanjing210095,China;2.Schoolof Food Science,Nanjing Xiaozhuang University, Nanjing 211171, China; 3.College of Animal Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China）

Abstract:In poultry breeding, chicken gender is closely related to its productivity.For the rapid and nondestructive detection on the gender of chicken embryos in early period during the whole hatching, a laboratory hyperspectral imaging system was setup to capture hyperspectral transmission images of 94 hatching eggs on days 2, 4, 6, 8, 10 and 12, at the spectral region of 400～1 000 nm.On the 16th day during the hatching, chicken egg embryos were broken for gender determination by human visual inspection from three trained experts, due to the fact that the difference in morphology between male and female chicken embryos is enough to be identified by human vision on day 16.After comparisons among the images information between male and female embryos, no clear differences was found.Therefore, the spectral information was further analyzed.The regions of interest（ROIs）were selected at big head, middle part and small head of egg for spectral response extraction.For the optimal time and location selection for gender determination, three models including linear algorithm（partial least squares discriminant analysis, PLSDA）and nonlinear algorithm（support vector machine, SVM; artificial neural network, ANN）were built by using full band spectral response, and the discrimination accuracy for male and female embryos were compared at different time and locations based on different models.The results showed that all of the discrimination models had the best accuracy on the 10th day of incubation as well as the ROI located on the middle of egg.Next, the average spectral response difference between male and female embryos was analyzed.600～900 nm was determined by removal of bands of 400～599 nm and 901～1 000 nm, which had little difference between male and female embryos, to build the gender discrimination models based on SVM, PLSDA and ANN.The results showed that the accuracy of SVM and PLSDA were both 75.00% for prediction, which were better than the accuracy with 71.88% for both SVM and PLSDA, based on full band spectral response on day 10 and middle part.For ANN, the prediction accuracy was 82.86%, by an increase of 2.86% compared with full band spectral response.Furthermore, the overall prediction performance of ANN model had better results for gender detection than SVM and PLSDA.The results in the study showed that hyperspectral imaging technology has the potential to identify the gender of early hatching chicken eggs embryos, but the accuracy of identification may be affected by the individual differences of hatching egg.So, in further research, more samples, physicochemical and biochemical differences between male and female embryos in various developmental stages were suggested to be incorporated for higher accuracy acquision of gender discrimination.

Keywords:spectrum analysis; imaging processing; nondestructive examination; hyperspectral image; hatching egg; early incubation; embryos; gender determination

通信作者：※屠康，男，江蘇南京，教授，博士生導師，博士。主要研究農產品貯藏與加工和農產品無損檢測。南京南京農業大學食品科技學院，210095。Email：kangtu@njau.edu.cn

作者簡介：潘磊慶，男，湖北鄖縣，副教授，博士。主要從事農產品無損檢測研究。南京南京農業大學食品科技學院，210095。Email：pan_leiqing@njau.edu.cn

基金項目：國家科技支撐項目（2012BAD28B01，2015BAD19B03）；中央高校基本科研業務費專項（KYLH201504）

收稿日期：2015-09-08

修訂日期：2015-11-23

中圖分類號：S123

文獻標志碼：A

文章編號：1002-6819（2016）-01-0181-06

doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2016.01.025