強志組方對多發性抽動癥復合恐懼行為大鼠的影響

金　枝，閻兆君，李亞群，趙興友，吳金勇，襲雷鳴

(1. 山東中醫藥大學，濟南　250000；2. 山東中醫藥大學附屬醫院，濟南　250000)

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研究報告

強志組方對多發性抽動癥復合恐懼行為大鼠的影響

金枝1，閻兆君2，李亞群1，趙興友1，吳金勇2，襲雷鳴2

(1. 山東中醫藥大學，濟南250000；2. 山東中醫藥大學附屬醫院，濟南250000)

【摘要】目的探究強志組方治療多發性抽動癥(TS)復合恐懼行為的作用機制。方法腹腔注射亞氨基二丙腈(IDPN)建立TS大鼠模型后，進一步聲電刺激建立TS復合恐懼大鼠模型，給予不同藥物灌胃治療后，采用曠場試驗、行為學檢測大鼠行為變化，高效液相法(HPLC)檢測腦組織中多巴胺(DA)的含量，免疫組織化學法檢測酪氨酸羥化酶(TH)的含量，RT-PCR檢測TH mRNA 的表達。結果與正常對照組相比，模型對照組刻板行為、運動行為增加，凍結時間延長，腦組織中 DA、TH、TH mRNA 含量無明顯變化；與模型對照組相比，強志組方組刻板行為、運動行為減少，凍結時間縮短，腦組織中 DA、TH、TH mRNA 含量減少。結論強志組方可改善模型大鼠抽動復合恐懼行為，其作用機制可能是通過下調 TH mRNA表達，降低 TH 含量，減少 DA 合成實現的。

【關鍵詞】強志組方；多發性抽動癥；恐懼行為；多巴胺；酪氨酸羥化酶；

多發性抽動癥(Tourette syndrome, TS)是兒童時期常見的精神行為性疾病，且在疾病的發生和發展過程中常常伴隨恐懼行為等臨床表現[1]。目前本病的發病機制仍不十分明確，普遍認為本病的發病與神經遞質系統的異常有關。部分研究表明患兒腦紋狀體存在多巴胺(dopamine, DA)活動過度現象[2]。酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase, TH)是 DA 合成過程中的限速酶，其含量影響 DA 的生成，兩者之間密切關系。強志組方由巴戟天、制遠志、茯神、清半夏、天麻、山藥、大棗等藥物組成，具有強志定意，安魂助勇之效，臨床上用于治療多發性抽動癥，已取得顯著療效[3]。本研究基于3,3-氨基二丙腈((3,3’-iminodipropionitrile, IDPN)誘導的 TS 大鼠模型，與恐懼行為模型相復合建立復合大鼠模型，觀察強志組方對大鼠模型行為學及腦組織中 DA、TH、TH mRNA 的影響，以探討強志組方的作用機制。

1材料和方法

1.1實驗動物及實驗環境

SD 雄性大鼠，48 只，體重(200 ± 20)g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號為 SCXK(京)2014-0004，質量合格證號11401300018142。實驗在山東中醫藥大學附屬醫院動物實驗室進行，許可證號：SYXK(魯)2011 0019。

1.2儀器與試劑

Agilent 1100高效液相色譜儀(Agilent)，用于含量測定。RM 2235轉輪式切片機(Leica)、TP 1020自動脫水機(Leica)、ST 5020多功能染色機(Leica)用于免疫組化檢測。AB17500 PCR 儀(AB & Invitrogen)用于 PCR 檢測。

強志組方是由巴戟天、制遠志、茯神、清半夏、天麻、山藥、大棗等藥物組成，購自山東中醫藥大學附屬醫院藥劑科。硫必利片，購自江蘇恩華藥業集團有限公司，批號為 201306181。IDPN 購自 Sigma 公司。DA、NE 標準品均購自中國藥品生物制品檢定所。一抗 Rb a tyrosine hydroxylase 購自北京博奧森生物技術有限公司。SP 檢測試劑盒、DAB 顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。TRIzol、逆轉錄試劑盒購、熒光定量試劑盒購自于天根生化科技有限公司。

1.3動物實驗

1.3.1造模方法： 大鼠適應性喂養1周，腹腔注射 IDPN，300 mg /kg，1 次/d，連續注射 7 d，誘導大鼠出現抽動癥狀。抽動造模完成后，適應性喂養1周。將大鼠單獨放入聲電刺激儀，前 5 min 為適應期，之后給予 2 S 噪聲信號(“滴滴”兩聲)并緊跟 1 S 電擊(2 mA)，間隔 1 min，每天 30 次，共 5 d。第 6、7 天實驗只予噪音信號，不予電擊；聲電刺激連續重復 3 周。

1.3.2分組與給藥： 大鼠隨機分為正常對照組、TS 復合恐懼行為組(簡稱模型對照組)、強志組方組(5 g /kg)、硫比利組(25 mg /kg)，每組 12 只。連續灌服 4 周，正常對照組、模型對照組同時灌服等量生理鹽水。末次給藥后禁食不禁水 24 h，斷頭取腦，冰盒上快速剝離大鼠腦組織，拍照，電子天平稱重，分裝后冷凍保存待檢測。

1.3.3曠場試驗：曠場試驗綜合評價抽動行為與恐懼行為。將動物置于曠場試驗箱中(長×寬×高：100 × 100 × 50)cm，周壁為黑色，底面分成面積相等的 25 方格的曠場里。攝像記錄動物 5 min 的行為，以穿越底面的格數為水平活動得分，以直立抬首的次數為垂直活動得分，曠場實驗得分為兩者之和。行為評定采用盲法，由 2 名觀察者觀看錄像后評分，取其平均值，電腦記錄其活動軌跡。

1.3.4刻板行為與運動行為測試：在安靜、避光環境下，將大鼠放置于曠場試驗箱中適應 5 min，按照文獻[4]中對 TS 大鼠模型刻板行為的評分方法，在末次給藥 1 h后，進行雙盲觀察 1 h，每 5 min 記錄 1 次，并統計其總分平均值。評分標準見表 1。在進行刻板行為測試同時進行運動行為測試。按照文獻方法[4]，在末次給藥 1 h后，進行雙盲觀察 1 h，每 5 min 記錄 1 次，并統計其總分。評分標準見表 2。

表1　刻板行為測試評分標準

表2　運動行為測試評分標準

1.3.5恐懼行為檢測: 恐懼行為學檢測通過凍結時間判定。模型對照組大鼠在第 6、 7 天實驗噪音后出現凍結姿勢 (freezing posture)，表現為靜止、呆滯、蜷縮、蹲伏等，期間僅有呼吸和輕微搖擺運動。其總時間稱為凍結時間 ( freezing time)，凍結時間總時間(單位：s)即為大鼠恐懼行為學得分。行為評定采用盲法，單位以秒來計算。每測定完 1 組大鼠，氨水清潔自主活動箱中大鼠排泄物，以消除對下只鼠自主活動的影響。

1.3.6腦組織中單胺類神經遞質 DA 檢測:取腦組織 100 mg 放入玻璃勻漿器中，加入高氯酸 500 mg，充分勻漿，離心(12 000 r/min，15 min，4℃)，仔細收集上清液，經 0.20 μm 濾器過濾后取 20 μL注入高效液相色譜儀中。色譜條件：固定相分析柱為 C18 反相色譜柱(250～x 4.6 mm)，流動相組成 A 為 0.02 mol/L 磷酸二氫鉀緩沖液，B 為乙腈。流速為 1 mL/min。柱溫保持在 35℃,熒光檢測器波長設置為：激發波長 280 nm，熒光波長 315 nm，以峰面積定量，根據標準曲線計算出大鼠腦組織內 DA 含量。

1.3.7腦組織中 TH 的檢測：免疫組織化學法檢測大鼠腦組織中 TH。大鼠腦組織用 4% 中性甲醛固定 24 h，石蠟包埋，切片，常規脫蠟至水，蒸餾水沖洗，PBS 浸泡 5 min。含 3% H2O2的去離子水孵育15 min，以消除內源性過氧化物酶活性。滴加試劑 A(藍色液體)室溫孵育 15 min，傾去液體。滴加一抗，4℃ 過夜。第2天取出后室溫平衡 10 min，PBS 沖洗 3 次，每次 3 min。滴加試劑 B(黃色液體)，37℃ 孵育 15 min，PBS 沖洗 3 次，每次 3 min。滴加試劑 C(橙色液體)，37℃ 孵育 15 min，PBS 沖洗 3 次，每次 3 min。DAB 顯色試劑盒顯色，自來水充分浸泡沖洗，蘇木素染液復染 5 s，脫水至透明，中性樹膠封片。同時 PBS 代替一抗作為陰性對照，顯微鏡下觀察細胞胞質或胞漿呈棕色或者棕黃色顆粒為陽性，不顯色為陰性。每組選取 10 張片，光學顯微鏡 200 倍隨機選取 10 個不重疊視野，采用 Leica Qwin V3 圖像分析軟件，對染色結果進行評分，在 200 倍鏡下隨機選取 4 個視野，進行灰度值測定，取平均值。

1.3.8腦組織中 TH mRNA 的檢測： RT-PCR 檢測腦組織中 TH mRNA 的含量。(1)TRIzol 試劑提取總 RNA：取腦組織 100 mg，液氮冷凍后低溫充分研磨，加入 1 mL TRIzol 試劑，靜置 5 min，加入氯仿 0.2 mL 混勻后室溫放置 3 min， 離心(4℃，12 000 r/min)取上清液 0.5 mL，加入異丙醇 0.5 mL 混勻后室溫沉淀 10 min，離心(4℃，12 000 r/min)棄上清液，加入 75% 乙醇(DEPC 水配置)混勻，離心(4℃，7 500 r/min)棄上清液，沉淀(即模板 RNA)略干后加入 DEPC 水 20 μL 備用。(2)RT 反應得 cDNA 模板：將10× RT Mix 2 μL、Super pure dNTPs 2 μL、Oligo-(Dt)152 μL、Quant Reverse Transcriptase 1 μL 震蕩混合均勻后加 RNsae-free 雙蒸H2O 及模板 RNA，保持總體積為 20 μL，渦旋震蕩混合均勻簡單離心收集管壁殘余液體，37℃孵育 60 min，得到逆轉錄產物 cDNA。(3)使用 SYBR Green I master mix 試劑盒進行 PCR 擴增：SYBR Green PCR Master Mix 10 μL、上游引物 2 μL、下游引物 2 μL、模板 2 μL、dd H2O 4 μL(總計20 μL)，均勻混合后入 PCR 儀進行擴增反應，測定 TH mRNA 濃度。其中上游引物為 GCAGCCCTACCAAGATCAAA，下游引物為CGCTGGATACGAGAGGCATA。

1.4統計學方法

2結果

2.1強志組方對復合大鼠模型自主活動的影響

與正常對照組相比，模型對照組自主活動減少(P<0.05)；與模型對照組相比，硫必利組、強志組方組大鼠自主活動增多(P<0.05)；與硫必利組相比，強志組方組無明顯變化(P>0.05)。(圖 1)。

2.2強志組方對復合大鼠模型刻板行為、運動行為的影響

與正常對照組相比，模型對照組全部造模完成后刻板行為、運動行為增多(P<0.05)；與模型對照組相比，硫必利組、強志組方組刻板行為、運動行為均減少(P<0.05)；與硫必利組相比，強志組方組治療刻板行為作用明顯(P<0.05)，治療運動行為硫必利效果明顯(P<0.05)。(圖 2、圖 3)。

圖1　強志組方對大鼠模型自主行為的影響Fig.1　Effects of “Qiangzhizufang” on autonomous behavior in the model rats

圖2　強志組方對大鼠模型刻板行為的影響Fig.2　The effects of “Qiangzhizufang” on stereotyped behavior in the model rats

圖3　強志組方對大鼠模型運動行為的影響Fig.3　The effects of “Qiangzhizufang” on exercise behavior in the model rats

2.3強志組方對復合大鼠模型恐懼行為的影響

與正常對照組相比，模型對照組全部造模完成后凍結時間延長(P<0.05)；與模型對照組相比，硫必利組、強志組方凍結時間縮短(P<0.05)；與硫必利組相比，強志組方組凍結時間明顯縮短(P<0.05)(圖 4)。

圖4　強志組方對大鼠模型凍結時間的影響Fig.4　The effects of “Qiangzhizufang” on freezing time in the model rats

2.4強志組方對復合大鼠模型腦組織內 DA 影響

與正常對照組相比，模型對照組大鼠腦組織中 DA 含量無明顯變化 (P>0.05)；與模型對照組相比，強志組方組腦組織中 DA 含量降低 (P<0.05) (表 3)。

2.5強志組方對復合大鼠模型腦組織內 TH 的影響

應用 SP 染色方法觀察各組大鼠腦組織中 TH 陽性率的變化，圖 5 為各組大鼠腦組織 TH 免疫組化染色圖片。與正常對照組相比，模型對照組大鼠腦組織中 TH 陽性率無明顯變化 (P>0.05)；與模型對照組相比，強志組方組腦組織中 TH 陽性率降低 (P<0.05) (表 3)。

表3　強志組方對大鼠模型腦組織中 DA、TH、TH mRNA 含量的影響

注：與正常對照組相比，(1)P>0.05；與模型對照組相比，(2)P<0.05。

Note. Compared with the normal control group,(1)P>0.05; Compared with the model control group,(2)P<0.05.

2.6強志組方對復合大鼠模型腦組織中 TH mRNA 的影響

與正常對照組相比，模型對照組大鼠腦組織中 TH mRNA 含量無明顯變化 (P>0.05)；與模型對照組相比，強志組方組腦組織中 TH mRNA 含量降低 (P<0.05) (表 3)。

圖5　大鼠腦組織免疫組化染色圖片(標尺=100 μm)Fig.5　The immunohistochemistry in brain tissue of model rats(Bar=100 μm)

3討論

TS 屬中醫學抽搐、慢驚風等范疇，是兒童時期常見的精神行為性疾病。臨床觀察發現 TS 的抽動動作不自主、無目的、重復，發作時可受意識控制暫時停止抽動，但不能持久，缺乏控制力是本病的特點，且在疾病的發生和發展過程中常常伴隨恐懼行為等臨床表現[1]。通訊作者認為疾病的發生與腎志不足相關，自擬強志組方治療本病，臨床取得明顯療效[3]。

目前 TS 動物模型的行為學體現不全面，僅能部分模擬臨床TS患兒的行為學和神經生化方面的改變[5-7]。IDPN 腹腔注射誘導建立 TS 大鼠模型被公認是理想的 TS 動物模型之一，目前已被廣泛用于 TS 發病機制及藥物作用機制的研究[8，9]。實驗發現，IDPN 連續腹腔注射 7 d后，大鼠刻板行為、運動行為增多，與文獻描述一致[10]，標志造模成功。后與恐懼模型復合，采用聲電誘導建立恐懼模型，自主活動減少，刻板行為、運動行為減少，凍結時間明顯延長，與文獻描述一致[11，12]，標志恐懼造模成功。本研究針對TS動物模型局限性，提出將TS大鼠模型與恐懼大鼠模型相復合，建立TS復合大鼠模型，考察強志組方治療效用與作用機制。與空白對照組相比，模型對照組自主活動減少，刻板行為、運動行為增多，凍結時間延長，標志 TS 造模與恐懼造模均成功復制。該復合模型既模擬了患兒的抽動行為，又模擬了患兒常常伴有的恐懼行為，可以較為綜合的評價藥物的治療效果。與模型對照組相比，強志組方組、硫必利組自主活動增加，刻板行為、運動行為明顯減少，表明硫必利與強志組方均可治療抽動癥狀；與模型對照組相比，強志組方組凍結時間縮短，而硫必利組無明顯改變，表明強志組方可緩解恐懼行為，而硫必利則無此方面作用。另外與硫必利組相比，強志組方組一般情況較好，體重增加明顯，提示強志組方具有療效好，不良反應少的優點。

TS 的發病機制尚未完全明確[13]，普遍認為此病的發生可能是由遺傳、免疫、神經生物、心理、社會、感染、創傷、及藥物濫用等因素單獨或聯合致病的結果[12]。其中，從神經生物學角度探討的神經生化學說最受關注[14]。目前眾多研究者認為此病的發生與 DA 系統的亢進有關，研究方向主要集中在 DA 異常分泌和 DA 受體超敏感方面[7]。而神經遞質的合成、儲存、釋放或降解的任何環節受到干擾，或遞質受體的功能異常，均可導致相應的神經精神功能的改變，如恐懼行為產生[15-16]。本研究中，與正常對照組相比，模型對照組中 DA 含量無明顯改變；與模型對照組相比，強志組方組 DA 含量下降。本研究中選用 IDPN 腹腔注射建立 TS 大鼠模型，關于其 DA 含量變化，文獻報道不一致[17]，普遍認為其可導致 DA 含量下降或保持不變[18-20]。采用聲電刺激建立恐懼大鼠模型，可導致 DA含量應激性升高[21]。本研究中 DA 含量無明顯改變，猜測可能是由于其 IDPN 誘導建立 TS 模型導致 DA 含量下降，而后又進行聲電刺激誘導建立恐懼模型導致 DA 含量應激性升高，兩者最終相抵導致含量無明顯變化。與模型對照組相比，強志組方組 DA 含量下降，硫必利組 DA含量無明顯變化，因此推測強志組方與硫必利作用機制可能存在不同。TS的發生主要認為DA 異常分泌增加和 DA 受體超敏感方面[7]，硫必利是多巴胺受體阻滯劑，因而考慮強志組方發揮作用可能是通過減少 DA 異常分泌而實現的。恐懼狀態下 DA 含量升高[20]，硫必利與多巴胺受體結合發揮治療作用而不具備減少 DA 含量的作用，從而可治療 TS 而不能改善恐懼行為，由此推測強志組方通過減少 DA 含量而發揮治療 TS 和恐懼作用的。

多巴胺神經元攝取血液中的酪氨酸，酪氨酸在 TH的催化下生成多巴，再經多巴胺脫羧酶作用生成DA。其過程中TH 是DA生物合成過程的限速酶，TH的含量影響 DA的合成。本研究中，與空白對照組相比，模型對照組TH無明顯變化；與模型對照組相比，強志組方組 TH含量下降，其變化趨勢與各組DA含量變化趨勢一致， TH mRNA變化趨勢與 TH變化趨勢一致，由此推測強志組方可能是通過減少 TH mRNA 的表達，降低TH含量，影響DA合成的。

綜上所述，強志組方能改善復合模型大鼠抽動行為、恐懼行為，其作用機制可能是通過下調 TH mRNA 的表達，降低 TH 的含量，從而影響 DA 含量而實現的。疾病的發生與諸多因素相關，強志組方是否存在其他作用機制還有待更深入的研究。

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〔修回日期〕2015-12-25

Effect of “Qiangzhizufang” on the rat model of Tourette syndrome combined with fear

JIN Zhi1, YAN Zhao-jun2, LI Ya-qun1, ZHAO Xing-you1, WU Jin-yong2, XI Lei-ming2

(1. Shandong University of TCM, Jinan 250014, China;2. Affiliated Hospital of Shandong University of TCM, Jinan 250014)

【Abstract】ObjectiveTo explore the functional mechanism of a Chinese medicine compound “Qiangzhizufang” on rat model of Tourette syndrome (TS) combined with fear. Methods The rat model of TS combined with fear was established by intraperitoneal injection of 3,3’-iminodipropionitrile (IDPN) combined with acoustic stimulation. After giving different drug lavage treatment, the changes of behavior of the rat models were assessed by field test and behavior test. The content of DA, TH and TH mRNA in the brain tissue was detected by HPLC, immunohistochemistry and RT-PCR, separately. ResultsCompared with the normal control group, stereotyped behavior and exercise behavior were increased, freezing time prolonged, but the content of DA, TH and TH mRNA in the brain tissue were not obviously changed in the model control group. Compared with the model control group, the stereotyped behavior and exercise behavior were decreased, content of DA, TH and TH mRNA in the brain tissue was decreased in the “Qiangzhizufang” group. ConclusionsThe Chinese medicine compound “Qiangzhizufang” can improve the behavior in rat models of TS combined with fear. This effect may be realized through down-regurating TH mRNA expression, reducing the content of TH, and reducing the dopamine synthesis.

【Key words】Qiangzhizufang, a Chinese medicine compound; Tourette syndrome, TS; Fear behavior; Dopamine; (DA); Tyrosine hydroxylase (TH); Brain; Rat

doi:10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.02.015

【中圖分類號】R-33

【文獻標識碼】A

【文章編號】1671-7856(2016) 02-0071-06

[作者簡介]金枝(1986-)，女，研究方向：中醫兒科學。E-mail: jinzi-1986@163.com。[通訊作者]閻兆君(1963-)，男，研究方向：中醫兒科學。Email： yanzhaojun7790@sina.com。

[基金項目]山東省科技發展計劃項目(編號：2009GG20002048)。