針刺結合丹紅注射液對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用

曾兆祿， 韓繼超， 薛　云，馬玉奎

(1. 山東省臨朐縣人民醫院，臨朐，山東　262600；2. 濟南市第一人民醫院，濟南，山東　250011；

3. 山東省藥學科學院，濟南，山東　250033)

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研究報告

針刺結合丹紅注射液對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用

曾兆祿1， 韓繼超2， 薛云3，馬玉奎3

(1. 山東省臨朐縣人民醫院，臨朐，山東262600；2. 濟南市第一人民醫院，濟南，山東250011；

3. 山東省藥學科學院，濟南，山東250033)

【摘要】目的研究針刺結合丹紅注射液對大鼠腦缺血再灌注損傷有無保護作用。方法采用大腦中動脈內栓線阻斷法(MCAO)制備大鼠大腦中動脈腦缺血再灌注損傷模型，缺血2 h后將線拔出實現再灌注，分別于再灌注后立刻靜脈注射丹紅注射液2 mL/kg，并針刺百會、足三里，每天1次，連續3 d，72 h后采用Zea-Longa的5級4分制評分方法進行神經功能評分，TTC染色法測定腦梗死面積， Western blot法檢測缺血側腦皮層中Bcl-2與Bax的蛋白表達。結果與模型和單用丹紅注射液組比較，針刺結合丹紅注射液治療后大鼠神經功能缺陷評分明顯降低，腦梗死面積減少，Bcl-2 的蛋白表達增多，Bax蛋白表達減少。結論針刺結合丹紅注射液比單用丹紅注射液對大鼠腦缺血再灌注損傷具有更明顯的保護作用。

【關鍵詞】針刺；腦缺血再灌注損傷；Bcl-2；Bax

臨床上對于缺血性腦血管病的首要治療原則是盡早重建血液再灌，恢復腦部的血氧供應，使缺血腦組織重新獲得營養物質供應并及時地將有害的代謝產物清除掉。重建血液再灌，一方面可使缺血的腦組織及時得到血氧供應，抑制受損腦組織神經細胞死亡，有利于神經元功能的恢復；另一方面可進一步加重缺血腦組織的病理損害，使病情惡化，引起腦缺血再灌注損傷，故防止再灌注損傷是目前治療缺血性腦血管疾病的重要環節和瓶頸[1]。丹紅注射液是從丹參和紅花中提取的含有丹參素、丹參酚A等成分的中藥注射液，具有抗炎抗氧化及神經保護作用，臨床上被廣泛用于急性缺血性腦病[2]。但是缺血性腦病發病機理比較復雜，單用一種藥物難以取得滿意的療效。針灸作為一種中醫治療方法已經在腦血管病治療中得到應用[3]，但單用療效有限，治療作用難以得到證實，這也直接影響了該方法在臨床上的應用。本文采用針刺結合丹紅注射液的方法研究其對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用，為臨床推廣應用提供參考依據。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1動物及飼養環境： SD大鼠(SCXK(京)2012-0001)，雄性，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。SPF級環境飼養，室溫(20～26)℃，濕度40%～70%，日溫差≤4℃，晝夜明暗交替時間12 h/12 h。實驗動物使用許可證號：SYXK(魯)2014 0008。

1.1.2藥品與試劑： 丹紅注射液(菏澤步長制藥有限公司提供，批號130808)；Western blot用抗體Bcl-2，Bax，GAPDH(美國Santa Cruz Biotechnology公司提供)；紅四氮唑(TTC)(天津市科密歐化學試劑開發中心提供，批號20100413)。

1.1.3儀器：HC-3018R型高速冷凍離心機(科大創新股份有限公司中佳分公司制造)；封膜機(美國Fisher Scientific制造)；SSW-600-2S型電熱恒溫水槽(上海博迅實業有限公司醫療設備廠制造)；微量加樣器(美國艾本德公司制造)。

1.2方法

1.2.1大鼠局灶性腦缺血再灌注模型的建立[4]：大鼠造模前禁食24 h不禁水，采用腹腔注射350 mg/kg的10%水合氯醛麻醉后將大鼠仰臥固定于手術臺上，剪去切口部位的被毛，切開頸部正中部位的皮膚，分離暴露右側頸總動脈(CCA)，向上分離右頸外動脈(ECA)遠端1 cm、結扎ECA分支，在近CCA分叉處結扎ECA，用動脈夾夾閉CCA近心端，用眼科剪在ECA結扎處與分叉處之間做一切口，將栓線自切口處插入，收緊線結，將動脈夾松開，將尼龍線順ECA經頸內動脈(ICA)慢慢送入顱內，插入深度為 (18.5±0.5)mm，阻斷MCA的血供，收緊絲線，將線尾端暴露于切口外，層層縫合切口。阻斷血流2 h后，同法將再次麻醉大鼠，將尼龍線線栓慢慢退出至有阻力感，使其頭端回到CCA分叉處，大腦中動脈重新獲得血液供應，實現再灌注，剪斷線栓， 完成MCAO模型制備。假手術組僅進行右側頸總動脈、頸內動脈、頸外動脈的分離，不進行栓塞。

1.2.2動物分組及給藥：選取造模成功大鼠40只，按照神經功能缺陷評分均衡原則分為4組，分別為假手術組、模型組、丹紅注射液 2 mL/kg組和針刺結合丹紅注射液 2 mL/kg組，造模后丹紅注射液組靜脈給予丹紅注射液，另一組給予丹紅注射液后針刺百會穴和左側足三里穴，得氣后接脈沖電療儀，采用疏密波，頻率2～100 Hz，強度2 mA，每次20 min[5]。每天給藥或針刺1次，連續3 d。假手術組和模型組給予相同容積的生理鹽水。

1.2.3神經功能缺陷評分：腦缺血2 h再灌注72 h后，參考Zea-Longa[4]的評分標準對實驗大鼠進行5級4分制神經功能評分，各個分值之間按照觀察的具體情況可增減0.5分。評分標準為0分：未觀察到明顯的神經功能缺失癥狀；1分：提尾懸空時梗死半球對側前肢不能完全伸展；2分：行走時向偏癱側及左側旋轉；3分：自主運動時向左側傾倒；4分：不能自發行走，意識水平降低。MCAO模型組1-3分提示模型復制成功，0分、4分或死亡者剔除。

1.2.4腦缺血面積測定[6]：10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后，打開胸腔暴露心臟，用4℃預冷生理鹽水快速進行心臟灌流。取腦經生理鹽水漂洗后置-20℃冰箱中冷凍10 min，然后將以2 mm為間隔進行腦組織冠狀切片，置于2% TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)生理鹽水溶液中，37℃避光染色30 min。待顯色后置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h后對采用圖像處理軟件(Adobe Photoshop 7.0)對缺血面積進行處理和統計，計算缺血面積。最終腦缺血面積以占總面積的百分率表示。

1.2.5Western blot檢測大鼠缺血側腦皮質Bcl-2、Bax蛋白水平：取50 mg腦組織，剪碎，用預冷PBS液洗滌兩遍，加入300 μL RIPA組織裂解液和3 μL PMSF，超聲波粉碎，置冰上裂解20 min。4℃離心，15 000 r/min，20 min。吸取上清液采用BCA法測定組織蛋白濃度。用12%分離膠和5%積層膠灌膠后，將凝膠置電泳槽中，上下游均加入電泳緩沖液。取蛋白樣品上樣。Bcl-2、Bax每孔均上樣50 μg，同時對稱上樣marker。電泳開始電壓為30 V，當溴酚藍進入分離膠后，將電壓調至100 V，電泳3.5 h后切斷電源。取下凝膠用于轉膜。分別剪取6塊濾紙和1塊硝酸纖維素膜(NC膜)，浸入轉移緩沖液中將塑料架放入含有轉移緩沖液的托盤中，按負極到正極的順序將轉移海綿，濾紙，PAGE膠，NC膜，濾紙，轉移海綿依次放置在塑料架上，夾上轉移夾，放入轉移槽中。膠靠負極，NC膜靠正極。 接通電源，電壓100 V，冷室轉膜l h。 轉移結束后，將NC膜浸入麗春紅染液中染色后將NC膜放入培養皿中，加5%脫脂奶粉，4℃封閉過夜。平皿中加入一抗，放入NC膜，4℃搖床過夜后加二抗反應。反應完畢后將ECL顯色液加到NC膜的正面，反應1 min，進入暗室，將NC膜放入Kodak增感屏，于NC膜正上方放置膠片，曝光，顯影，定影。顯影后可見密度強度不同的條帶。將顯色的膠片圖像輸入凝膠分析系統，應用ID Image Analysis Software進行表達強度測定。

2結果

2.1針刺結合丹紅注射液對MCAO大鼠神經功能缺陷評分的影響

與模型組比較，給予丹紅注射液后大鼠的神經功能缺陷有一定程度減輕，而結合針刺后神經功能缺陷明顯減輕，與模型組和單用丹紅注射液組比較差異均有顯著性(P<0.05或P<0.01)，說明針刺結合丹紅注射液能明顯改善模型大鼠神經功能缺陷，其效果好于單用丹紅注射液。見圖1。

*P<0.05, **P<0.01 vs 模型組; #P<0.05 vs. 丹紅注射液組圖1　針刺結合丹紅注射液對MCAO大鼠神經功能缺陷評分的影響Note. DH: Danhong injection group. AC+DH: Acupuncture plus Danhong injection. The same as below.Fig.1　The effects of acupuncture combined with Danhong injection on the neurological deficit scores of the rats ±s，n =10).

2.2針刺結合丹紅注射液對MCAO大鼠腦缺血面積的影響

與模型組比較，給予丹紅注射液后大鼠腦缺血面積減少，而結合針刺后腦缺血面積減少更明顯，與模型組和單用丹紅注射液組比較差異均有顯著性(P<0.05或P<0.01)，說明針刺結合丹紅注射液能明顯抑制模型大鼠腦缺血，其效果好于單用丹紅注射液，見圖2。

*P<0.05, **P<0.01 vs. 模型組; #P<0.05 vs. 丹紅注射液組圖2　針刺結合丹紅注射液對MCAO大鼠腦缺血面積的影響Fig.2　The effects of acupuncture combined with Danhong injection on infarct volume in the rat brains ±s，n =5).

2.3針刺結合丹紅注射液對MCAO大鼠缺血側腦皮質區Bcl-2/Bax蛋白表達水平的影響

與模型組比較，給予丹紅注射液后大鼠腦缺血側皮質區 Bcl-2 蛋白表達增加，Bax蛋白表達降低(P<0.05)，而結合針刺后腦缺血皮質區 Bcl-2 蛋白表達增加更明顯，Bax蛋白表達降低更顯著(P<0.01)，與模型組和單用丹紅注射液組比較差異均有顯著性(P<0.05或P<0.01)，說明針刺結合丹紅注射液能更明顯抑制模型大鼠腦缺血側皮質區凋亡相關蛋白的表達，其效果好于單用丹紅注射液，見圖3。

s. 模型組; ##P<0.01 vs. 假手術組; P<0.05, vs. 丹紅注射液組圖3　針刺結合丹紅注射液對MCAO大鼠缺血側腦皮質區Bcl-2/Bax蛋白表達水平的影響Fig.3　Effect of acupuncture combined with Danhong Injection on Bcl-2 and Bax expression levels in the ischemic penumbra cortex. ±s，n=5)

3討論

大腦中動脈栓塞 (MCAO)模型是目前用來評價急慢性腦缺血再灌注損傷藥物最為經典的模型，此模型與人類腦卒中病理生理過程最為接近。通過閉塞大腦中動脈2 h后再復灌，使大腦中動脈供應區的血流先減少或全無后再恢復血液和氧氣供應，造成腦組織缺血缺氧，能量代謝障礙，導致神經細胞壞死或凋亡，與臨床局灶性腦缺血的發病過程和機制基本類似。此模型可以用來定性、定量地觀察缺血腦組織的病理生理變化和評價治療的療效。神經功能缺陷評分和腦梗死面積是評價腦缺血再灌注損傷程度的重要指標之一。以往研究發現，Bcl-2表達高低與腦缺血再灌注損傷的嚴重程度密切相關，在缺血再灌注損傷的動物模型中，Bcl-2表達量與神經細胞凋亡數量呈負相關，Bcl-2基因被敲除后，神經功能缺陷變嚴重，梗死面積會擴大，會加劇腦缺血再灌注后的神經細胞損傷[7]。Bax被稱為“死亡基因”，表達過多則促進細胞凋亡，加重缺血再灌注損傷。故腦缺血再灌注損傷后 Bcl-2 和Bax 表達的比例決定著細胞在凋亡信號的作用下是否出現凋亡及凋亡的發生率，當Bax 蛋白表達占優勢時促進細胞發生凋亡，而當 Bcl-2 蛋白表達占優勢時則抑制細胞凋亡[8]。

本實驗采用了Zea-Longa評分法對神經功能缺陷進行評分，采用可以快速對梗塞范圍能夠直觀定量的TTC 染色法對梗死區域進行檢測，Western lot法檢測了模型大鼠缺血側腦皮質區Bcl-2和Bax蛋白水平，探討針刺結合丹紅注射液對腦缺血再灌注的神經保護作用。結果顯示與假手術組比較，模型組大鼠神經功能缺陷評分明顯升高，腦缺血面積明顯增加，腦組織內Bax蛋白表達顯著升高，而Bcl-2 蛋白表達顯著降低，此實驗結果與文獻報道一致[9]，充分證實了模型復制成功。與模型組比較，丹紅注射液組大鼠神經功能缺陷評分降低，缺血面積減少，腦缺血皮質中 Bcl-2 蛋白表達升高，而Bax蛋白表達降低。同時應用針刺后，以上指標的變化更明顯，且與丹紅注射液組比較均有顯著性差異。以上結果提示，丹紅注射液對腦缺血再灌注損傷具有一定的保護作用，但結合針刺后效果更明顯，故臨床上對于腦缺血性疾病的治療可靜脈滴注丹紅注射液后再給予針刺治療，可進一步提高療效。

參考文獻：

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〔修回日期〕2015-11-17

Neuroprotective effect of acupuncture combined with Danhong injection on focal cerebral ischemia/reperfusion injury in rats

ZENG Zhao-lu1, HAN Ji-chao2, XUE Yun3, MA Yu-kui3

(1. People’s Hospital of Linqu County, Shandong Linqu 262600, China;2. the first People’s Hospital of Jinan, Jinan 250011; 3. Shandong Pharmaceutical Academy, Jinan 250033)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the neuroprotective effect of acupuncture combined with a Chinese medicine, Danhong injection, on focal cerebral ischemia/reperfusion injury in rats. Methods Middle cerebral artery (MCA) occlusion was prepared by putting a nylon suture in the MCA. The MCA blood flow in the animals was restored at two hours after the MCA occlusion by withdrawing the suture to the external carotid artery (ECA). The acupoints “Baihui”(DU20) and “Zusanli”(ST36) were acupunctured and stimulated by twirling the acupuncture needle after reperfusion, and the rats were also administered with Danhong injection by intravenous injection, once every day for three days. Zea-Longa scores were recorded to assess the changes of neurological function. The rats were sacrificed at 72 h after reperfusion. Triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining was used to measure cerebral infarction size. Western blot was used to test the level of Bcl-2 and Bax in the ischemic penumbra. ResultsThe acupuncture combined with Danhong injection treatment group displayed markedly lower neurologic deficit scores, reduced ischemic infarct surface, increased expression of Bcl-2 protein, and reduced expression of Bax protein, compared with those in the model group and Danhong injection alone group. ConclusionsAcupuncture combined with Danhong injection show more significant neuroprotective effect than Danhong injection treatment alone on rat models of cerebral ischemia/reperfusion injury.

【Key words】Acupuncture; Danhong injection; Cerebral ischemia/reperfusion injury; B cell lymphoma/lewkmia-2; Bcl-2-associated protein

doi:10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.02.013

【中圖分類號】R-33

【文獻標識碼】A

【文章編號】1671-7856(2016) 02-0062-05

[作者簡介]曾兆祿(1971-)，男，主管藥師，本科， 研究方向： 針灸理療。[通訊作者]馬玉奎 (1975-)，男， 副主任藥師，博士，研究方向：新藥藥理毒理評價。 E-mail： yukuima@sina.com。