李梅閣,吳亞君,楊艷歌,徐幸蓮,陳 穎,*(.中國檢驗檢疫科學研究院,北京 0076;.南京農業大學食品科技學院,江蘇 南京 0095)
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漿果果汁真偽鑒別技術研究進展
李梅閣1,2,吳亞君1,楊艷歌1,徐幸蓮2,陳 穎1,*
(1.中國檢驗檢疫科學研究院,北京 100176;2.南京農業大學食品科技學院,江蘇 南京 210095)
摘 要:以藍莓、樹莓為代表的漿果類水果素有“黃金水果”的美譽,由于產量低、保質期短和價格高昂,漿果果汁摻假、造假、錯誤標簽等導致的食品質量和安全爭議不斷發生,果汁真偽鑒別技術面臨巨大挑戰。目前,常用的漿果真偽檢測方法主要是常規理化法和傳統的分子生物學方法,這些方法在漿果果汁鑒定上各有優缺點。如理化方法的優勢在于漿果的質量控制和品質評價,對產品中植源性成分的識別易受個體生長發育、加工條件等外部因素的影響;而基于DNA的分子生物學方法更多的用于果汁中植源性成分的識別。面對漿果果汁摻假造假現象,本文綜述了近年來常用于漿果及其果汁質量控制和真偽鑒別技術的研究進展,主要包括感官技術、理化技術和分子生物學技術。
關鍵詞:漿果果汁;真偽;感官技術;理化技術;分子生物學技術
引文格式:
李梅閣, 吳亞君, 楊艷歌, 等.漿果果汁真偽鑒別技術研究進展[J].食品科學, 2016, 37(13): 243-250.DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201613044. http://www.spkx.net.cn
LI Meige, WU Yajun, YANG Yange, et al.Progress in authentication technologies for berry juice[J].Food Science, 2016,37(13): 243-250.(in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201613044. http://www.spkx.net.cn
近年來,以蘋果、桃、梨為代表的第一代水果,獼猴桃、山楂、草莓為代表的第二代水果在市場上已漸漸趨于飽和,以藍莓、樹莓為代表的漿果類水果作為第三代水果開始大量涌入市場。漿果是由一個含有子房的花發育而來,且具有很多種子的肉質水果[1],主要包括藍莓、蔓越莓、樹莓、黑加侖等。相較于常見的大宗水果,漿果的鮮果過于柔軟,主要以果醬、果汁以及果汁飲料的形式存在,是典型的加工型水果,如世界約95%的黑莓漿果用于加工[2]。有研究表明,由于漿果具有較高的抗氧化活性,經常飲用漿果類飲料有利于改善人體氧化狀態、降低心血管疾病以及預防各種代謝性疾病等[3]。占世界蔓越莓總產量78%的美國,其最大蔓越莓果汁生產商Ocean Spray僅在2001年的銷售額就超過13 億美元,至2010年,全美蔓越莓加工果在加工和鮮食中的比例更是高達98.6%[4];作為葡萄消費大國的巴西,其葡萄汁產量正以每年30%的速率遞增[5],進出口貿易呈現持續上升趨勢;并且據英國連鎖超市巨頭泰斯考統計,在英國果汁行業,濃縮石榴汁飲料的消費增速居于飲料業首位,由于其加工技術先進、產品質量較好,已成為廣受消費者喜愛的漿果飲料。
目前,中國果汁行業正以平均每年20%的增長率成為食品工業發展最快的行業[6],新興的漿果類飲料進出口貿易逐年增長,僅在2014年,葡萄汁進口量達到2010年的3.4 倍。漿果濃縮汁以及漿果類復合飲料市場份額不斷增大,尤以美國、加拿大等國產品居多,形成新的果汁消費市場。開展果汁真偽鑒別特別是小漿果類果汁的鑒別研究對打擊摻加制假、維護市場秩序都具有重要意義。本文就近年來常用于漿果果汁的多種真偽鑒別方法進行了評述。
根據GB/T 10789—2015《飲料通則》的規定,果汁是以水果為原料,采用物理方法(機械方法、水浸提等)制成的可發酵但未發酵的汁液制品,或在濃縮果蔬汁中加入其加工過程中除去的等量水分復原制成的汁液制品,如原榨果汁(非復原果汁)、果汁(復原果汁)、復合果汁等;果汁類飲料則是以果汁、濃縮果汁為原料,添加或不添加其他食品原輔料和(或)食品添加劑,經過加工制成的制品,如果汁飲料、果肉飲料、復合果汁飲料、發酵果汁飲料、水果飲料等。然而,隨著果汁行業的快速發展,果汁摻假現象越演越烈,高達60%~80%[7],而漿果果汁的摻假現象尤為嚴重。漿果果汁摻假的原因主要包括:1)營養價值遠遠超過傳統的大宗水果;2)產品需求量大;3)價格高;4)收獲期短和生產短缺等[8]。而無良廠家、公司或貿易者的摻假方式更是多種多樣,如添加深色的大宗水果替代高價漿果;標簽虛假標注漿果提取物含量;添加糖、水等完全勾兌的果汁;以老化漿果或漿液冒充新鮮果汁。這些摻假行為嚴重影響了漿果行業的聲譽、引起食品安全問題、降低消費者對果汁行業的信任。
針對漿果果汁摻假現象,各個國家以及國際機構頒布了一系列標準法規。在1993—1995年間,歐盟果蔬汁飲料工業協會陸續頒布了包括西番蓮汁、番石榴汁、樹莓汁、黑加侖汁等在內的漿果類水果指導標準。并且歐盟在2011年的新法規中明確對混合型果汁的規定,對含90%蘋果汁和含10%草莓汁的果汁一律標識為蘋果草莓汁,任何含有3 種以上水果成分的果汁都標注為“混合果汁”[9]。自2001年加入世界貿易組織(World Trade Organization,WTO)以來,我國陸續出臺了一系列果汁標準法規,如NY/T 291—1995《綠色食品 番石榴果汁飲料》、DB 44/T 274—2005《桑果汁及桑果汁飲料》、SL 353—2006《沙棘原果汁》等。為提升漿果類果汁產品的質量水平,加強漿果果汁市場的監管,亟需制定漿果類水果新標準、新措施、新方法,加大同國際標準接軌,提高國內漿果企業的競爭力,促進漿果產業的發展。
規范生產者自身的行為,提高消費者的安全意識,建立合理的標準法律法規,有利于遏制摻假行為,而準確、便捷的果汁鑒偽技術是政府監管、行業自律、企業質控的重要支撐。目前,對漿果果汁的真偽鑒別主要采用傳統的感官鑒別技術、常規理化鑒定技術和日益發揮重要作用的分子生物學技術。
2.1 感官鑒定
感官鑒定是發展最早的鑒定技術,是指對果汁的色(顏色、透明度和固形物)、香、味(風味和口感)、清汁、混汁等感官特征的初步識別,在日常生活中具有很大的實際意義。
漿果大部分為深色水果,其果汁尤其是濃縮果汁和果肉類漿果飲料相較于常見的大宗水果果汁(蘋果汁、梨汁等)顏色濃郁,香味醇厚。蘇格蘭作物研究所建立了基于感官分析的樹莓品種和樹莓果汁評價方法,并用于樹莓、黑加侖及其加工品的質量評價。研究結果顯示,感官屬性能明顯區分紅樹莓汁的外觀(顏色、豐富度、自然性)、香氣(強度、果香、花香)和味道,且香氣和味道具有很大的相關性[10]。但經加工的漿果果汁味道極為復雜,多種因素(品種、環境、采后因素、加工和貯藏條件等)影響著漿果果汁的味道和口感,而人的感官辨識度有限,并且具有很強的主觀性,導致驗證準確性降低。為了能精確測量人類對食品的反應程度,以感官評價為基礎的智能感官技術迅速發展起來,并在漿果果汁中得到應用。其中,電子鼻和電子舌是兩種最具代表性的智能感官鑒定技術。
電子鼻和電子舌都是以生物感官為基礎發展而來的現代感官鑒定技術。電子鼻是一種模仿生物嗅覺的儀器,通過電子化學傳感器結合局部特異性和適當的模式識別系統對簡單或復雜的氣味進行識別;與電子鼻原理相似,電子舌是模仿生物感受味覺的儀器,通過金屬或者聚合物傳感器來檢測溶液中物質電導率的變化,常被用來描述復雜液體食物中不同程度的甜味、酸味、咸味、苦味和澀味等[11-12]。兩種電子感官技術均能對樣品進行定性或定量分析,尤其是當兩種技術結合使用時,能大大提高樣品的鑒別能力。Kraujalyte等[13]對不同基因型的高叢藍莓、沼澤藍莓果汁進行電子舌感官檢驗,檢測到超過100 種揮發性物質,其中(Z)-3-己烯醇、(E)-2-己烯醛和萜類化合物如香葉醇、芳樟醇是藍莓的典型香氣成分,根據主成分分析法(principal component analysis,PCA)建立分類模型,能夠對不同基因型的藍莓果汁進行有效區分。同時,Siomon等[14]采用電子嗅探器技術檢測包裝藍莓的質量和成熟度。將盒裝藍莓放入與嗅探器相連的密閉室中,室內空氣不斷循環,從果實中散發出的頂隙氣體通過傳感器在一個預先設定的時刻連續測量。當藍莓散發揮發性氣體時,密閉室的氧氣被揮發性氣體取代,而嗅探器半導體表面的二氧化錫隨著空氣的減少其電導率增加,利用這種電導率的變化可以檢測總揮發物的濃度,最終在包裝藍莓的質量檢測中,發現5%的藍莓有軟或壞的現象,最終以4 個等級來區分藍莓的成熟度:綠色和綠粉色、藍粉色、藍色和成熟的藍莓,嗅探器的響應隨著果實的成熟不斷增強[15]。這種快速、無損的檢測技術能夠預測漿果的感官特征與消費者滿意度評定的關系,可用于新鮮封閉包裝漿果及其果汁制品的質量檢查和品種鑒定。
2.2 理化鑒定
除了感官鑒定,理化鑒定在漿果果汁的摻假檢測中應用最為廣泛,色譜技術、質譜技術以及光譜技術為主的理化鑒定方法實現對漿果果汁從單一成分到多成分的代謝組分析。其高維數據結合化學計量學算法同時使用,達到對漿果果汁中已知成分或未知成分的定性和定量檢測。其中,以PCA和偏最小二乘法(partial leasr square,PLS)在代謝組學數據分析中的應用最為廣泛。
漿果果汁中未知代謝組成分的分析主要采用PCA[16],通過降維將原來的綜合變量轉化為幾個綜合變量,由每個綜合變量進行線性組合,變量方差表示原始數據的信息量,方差最大信息量最高,為第一主成分,以此類推,得到果汁代謝組的主成分模型。PLS是已知分類信息的監督模式算法,在PCA的基礎上給出明確的分類信息,更有利于解決類與類之間的差異性。而反向傳播(back-propagation,BP)神經網絡以其高度非線性映射能力,解決果汁中復雜的非線性模式識別問題[17]。線性判別函數、二次判別函數以及交叉驗證實驗的互相結合得到代謝組成分的校正模型,最終確定漿果果汁中各種樣本的良好百分比分類。
2.2.1 色譜技術
2.2.1.1 氣相色譜
氣相色譜(gas chromatography,GC)主要利用物質的極性、沸點以及吸附性差異來實現混合物的快速分離,是一種分析速度快、分離效率高的分離分析方法。在目前已知化合物的色譜分析中,20%的混合物(包括15%的直接分析化合物和5%的衍生物)采用GC的指紋圖譜進行直接分析[18],其余以液相色譜分析為主。GC檢測多集中于對果汁中的衛生指標以及主揮發性成分的定性定量檢測,單獨的GC技術在果汁真偽鑒別中應用較少。
在常見的果酒類飲料中,甲醇和雜醇油是兩種必檢指標。童永鑫等[19]在檢測葡萄石榴混合發酵果酒時,利用GC技術檢測出葡萄石榴酒中不含甲醇成分,并且果酒中微量的雜醇油含量符合國家標準,建立了可同時對果酒中甲醇和雜醇油進行定量的GC技術。同樣,將GC技術用于甜蜜素等果汁添加劑的檢測,以甜蜜素與亞硝酸反應衍生物為靶目標,對果汁中的甜蜜素進行定量[20]。在PCA分析中,Larsen等[21]利用GC技術檢測到樹莓中含有200多種揮發性物質,其中只有10 種關鍵的風味化合物(α-紫羅蘭酮、β-紫羅蘭酮、順式-3-己烯醇、香葉醇、芳樟醇、苯甲醇、3-羥基丁酮、乙酸、己酸以及樹莓酮),并且發現其揮發性物質隨熱加工條件以及外源物質(奶油)的加入出現增加或減少的現象[22]。可見,這種揮發性物質隨加工條件的改變可能給果汁等深加工制品的檢測帶來一定的難度。為了對果汁進行真實性鑒定,往往需要與其他技術進行聯合處理分析。
2.2.1.2 液相色譜
液相色譜(liquid chromatography,LC)是以液體作為流動相的色譜方法,對混合物的檢測范圍相較于GC更廣。不同于GC的指紋圖譜,LC不能由色譜圖直接給出未知物的鑒定結果,必須以已知標準作參照進行檢測。目前,LC在食品檢測分析中的應用主要是高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC),HPLC克服了傳統LC技術不能對大多數金屬鹽類和熱穩定性差的物質進行檢測的缺點,在檢測低揮發性、離子型化合物和高分子化合物時極為有利[23],并已被列入檢測食品營養成分的國家標準。近年來,漿果中的花青素是漿果果汁LC真偽檢測的主要對象。
漿果是一類富含花青素的水果,其花青素含量遠高于常見的大宗水果。在應用LC進行紅色漿果(紅醋栗、接木骨、歐洲酸櫻桃、蔓越莓等)的游離花色苷含量的檢測中發現,接木骨中主要為矢車菊桑布雙糖苷和矢車菊雙葡萄糖苷,樹莓中主要是矢車菊-3-槐糖苷和矢車菊-3-葡萄糖苷,而矢車菊葡萄糖苷、矢車菊蕓香糖苷、花翠素葡萄糖苷、花翠素蘆丁糖苷在黑加侖中含量較多,并成功利用HPLC檢測不同紅色果汁中羥基酸以及軟飲料中的兒茶酚成分,結果表明,HPLC可用于紅色果汁和一些紅紫色軟飲料的質量控制和真偽鑒別[24-26]。Gardana等[27]以高效液相色譜耦合二極管陣列檢測器進行歐洲越橘的標簽符合性查驗,以15 種花青素成分分析了14 種越橘的提取物和12 種標簽為覆盆子的市售產品,其中66%的提取物和33%的市售產品花青素含量較低,與標簽含量不符。Soufleros等[28]利用LC技術對獼猴桃果酒和葡萄汁中的果糖、葡萄糖和蔗糖進行比較,獼猴桃果酒糖含量大于葡萄酒,可以用于獼猴桃果酒的感官評價。而新型液相色譜技術-手性膠束電動色譜-激光誘導熒光技術利用十二烷基苯磺酸鈉作為表面活性劑檢測石榴汁中的手性氨基酸,通過比較石榴汁和蘋果汁中的氨基酸,提出以L-天冬酰胺作為石榴汁中摻雜蘋果汁的標記[29]。
2.2.2 質譜技術
2.2.2.1 穩定同位素比率質譜
質譜技術(mass spectrometry,MS)是以檢測化合物中的氣相離子即離子質荷比進行鑒定的技術,豐富的結構信息、高特異性和高靈敏度使其在漿果及其果汁制品的產地溯源和真偽鑒別中具有普適性。其中,穩定同位素比率質譜(stable isotope ratio mass spectrometers,IRMS)通過檢測果汁中有機物同位素成分(如C、H、O、N等),已經廣泛應用于對還原果汁和非濃縮還原果汁、果汁中是否添加蔗糖或玉米糖漿的真偽鑒別中,并初步用于漿果果汁的產地溯源。
穩定性同位素(O、H和C元素)在果汁的抗氧化活性和摻假檢測中的研究已經有30多年的歷史。其中,相對于稀釋類果汁,真果汁中的重氧和重氫(18O和2H)同位素含量相對較低,這主要是由于自然中的雨水和自來水中的18O和2H含量不同,經稀釋了的果汁其同位素含量和自來水相近;而由不同光合作用途徑(C4和C3)產生的δ13C(13C/12C同位素比值,‰)值也具有顯著差異,摻雜了源自C4途徑糖漿的果汁其δ13C值低于C3類果汁,可以憑借這種差異對果汁中不同來源的糖漿(甘蔗或玉米糖漿)進行檢測鑒別。Vedeanu等[30]利用IRMS檢測4 種商業市售果汁(果蔬汁、維生素復合飲料、漿果果汁以及漿果類復合維生素汁)中的18O、2H以及糖漿含量。結果顯示,4 種市售果汁中18O和2H的含量均與自來水相近,屬于濃縮液稀釋果汁,與標簽相符,并且δ13C值表明沒有C4類糖漿,與報道結果相一致,即大多數的植物中的糖類是通過C3途徑產生的。類似的檢測在藍莓中也有相關研究,以IRMS技術分析藍莓中的13C和2H成分,通過分析肉桂酸和酒精的δ13CV-PDB和δ2HV-SMOW值,對藍莓中的肉桂酸和酒精進行定量[31]。另外,有研究采用多重比較、單向方差分析黑加侖果汁中的碳和氮同位素,發現不同產地黑加侖果實的δ15N值和δ13C值存在不同程度差異,且果汁和果實的碳和氮穩定性同位素有著顯著相關性,因而可以通過對產地果實以及市售果汁中的15N、13C檢測對黑加侖果汁進行有效溯源[32]。
2.2.2.2 電感耦合等離子體質譜
電感耦合等離子體質譜(inductively coupled plasmamassspectrometry,ICP-MS)是一種集實時檢測、在線分析、多元素同時分析的質譜技術,不同于IRMS的有機同位素法,ICP-MS主要是對漿果果汁中的微量元素和重金屬元素的分析,其檢測范圍更廣、檢測限更低,是漿果果汁痕量無機元素分析的強有力技術[33]。
果汁中的有機和無機元素一直是消費者關注的重點,質譜技術因其較好的分離能力和重復性,在果汁元素分析中占有巨大優勢。有研究采用ICP-MS對36 種市售葡萄漿果飲料(19 種有機葡萄汁和17 種普通葡萄汁)進行非靶目標成分的檢測,通過依次刪除樣本不斷建立新模型的簇類獨立軟模式法(soft independent modeling of class analogy,SIMCA)檢驗,建立獨立的PCA模型,對24 種主要元素進行分類,發現有機葡萄汁和普通葡萄汁中的大部分微量元素含量相近,但普通葡萄汁中的Na 和VA含量更高,能夠有效地將有機和無機葡萄汁進行區分,這種結合PCA和SIMCA分析法的ICP-MS可作為葡萄汁真偽鑒別的工具[34]。朱利娜等[35]在對青海地區的沙棘果汁進行ICP-MS的檢測結果顯示,在所有的微量元素中,沙棘果汁中Fe含量最高,其次為Zn、Mn和Cu,且不同顏色沙棘果汁中的微量元素存在顯著差異,依靠這種元素差異,可對不同沙棘品種進行選擇性開發和培育。Perez等[36]采用ICP-MS結合碳同位素和氮同位素對來自不同產地的新鮮藍莓果汁、草莓果汁和梨果汁中的多種元素(Ca、Cd、Cr、Cu、Fe、K、Mg等)進行研究,不同品種和區域采用方差多重比較分析,結合圖形演示和t檢驗驗證進行地理位置判別,果汁產地判別率高達70%~100%。可見,結合多元分析技術的ICP-MS通過對微量元素或痕量元素的分析,可對漿果果汁進行真偽鑒別、質量控制以及產地溯源。
2.2.2.3 氣相色譜-質譜聯用技術
漿果果汁經商業化處理后成分復雜,在不確定靶目標前提下,常規的單一理化技術很難解決未知摻雜物的難題。氣-質聯用技術(gas chromatography-mass spectrometer,GC-MS)將色譜分離和質譜定性能力相結合,以氣體為流動相,整個處理過程中無外來雜質引入,保證了揮發性組分的分離效率和結果的準確性,可對不適用于直接GC鑒定的低揮發性化合物快速分離鑒定。
Wang Chengjun等[37]以GC-MS結合超聲波水解對蔓越莓、蔓越莓果汁和蔓越莓果醬中的20 種酚類物質和苯甲酸化合物進行檢測,這些成分具有相對低的揮發性,不適合直接毛細管GC分析。在檢測結果的分析評價中,酚類物質的定量評價是基于峰面積比值作為內部標準,標準混合物制作校準曲線,在蔓越莓果實中檢測到20 種酚類物質均以共軛形式存在,以苯甲酸、槲皮素和楊梅素含量最高。不同于果實的直接GC-MS,蔓越莓產品中的酚類化合物的分離和定量相對較難,這主要是由于它們具有相似的化學結構以及蔓越莓產品的復雜性,需在操作前進行樣品預清理和分餾,最終檢測出100%蔓越莓果汁中9.1 mg/mL和蔓越莓果醬中11.1 mg/mL的總酚物質。石榴汁是另一種含酚量較高的漿果果汁,通過GC-MS技術分析石榴汁中的酚類物質及其抗氧化活性,對30 種非花色苷以及超過20 種花色苷成分進行識別,可有效地對石榴汁的總抗氧化成分進行定量[38]。
2.2.2.4 液相色譜-質譜聯用技術
同LC技術相比,液相色譜-質譜聯用技術(liquid chromatography-mass spectrometer,LC-MS)具有分析速度快、靈敏度和分辨率高、多組分同時測定的優點,在分離分析漿果果汁中的代謝組成分和外來添加物中具有顯著優勢。
漿果中有機酸的檢測一直是果汁真實性判別的有效成分。石榴汁中含有酒石酸和奎寧,其含量在1~5 mg/L,這些質量濃度遠低于摻雜了葡萄汁和蘋果汁的石榴汁,僅達到5%的水平[39],因此可以通過LC-MS檢測酒石酸含量來判定石榴汁真偽。但是常規的檢測方法(例如美國分析化學家協會的官方方法是反相或離子交換液相色譜結合紫外檢測)在果汁有機酸檢測中的重復性較差,對次要有機酸的測定結果往往偏高,經常給出酒石酸的假陽性或陰性結果,造成以葡萄汁或蘋果汁摻假石榴汁的可能性,但LC-MS技術能夠避免這種假陽性的出現,并對不同品種石榴汁的總酚含量和抗氧化活性進行檢測分析,其結果準確,重復性好[38]。同樣,利用超高效液相色譜-四極桿串聯飛行時間質譜(ultra high performance liquid chromatography/quadrupole tandern time-of-flight mass spectrometry,UPLC/Q-TOF-MS)檢測藍莓中的有機酸,其奎尼酸含量遠超過檸檬、葡萄、橘子等水果,而綠原酸作為藍莓果汁的主要酚酸物質,其質量濃度高達210~850 μg/mL,可用于藍莓果汁的真實性檢測[13]。特征性化學成分的識別是漿果及其果汁檢測的另一重要組成部分。甲基酮類化合物樹莓酮是樹莓的特征氣味成分[40],單獨依靠GC技術和分光光度法檢測不到低濃度的樹莓酮成分,而HPLC-MS以其較高的靈敏度,能夠檢測到樹莓汁中較低含量的樹莓酮,因而可利用這種特征成分的方法用于樹莓及其他漿果果汁的真偽識別。
2.2.3 光譜技術
2.2.3.1 紅外光譜
不同物質含有不同化學成分,這些化學成分的組成及其分子結構決定了它們各自具有獨特的紅外光譜。根據射線的波長范圍可分為遠紅外、中紅外(midinfrared,MIRS)和近紅外光譜(near infrared,NIR)。其中,無損檢測的MIRS和NIR是紅外活性中吸收最強的振動區域,主要反映了C—H、O—H、N—H等化學鍵的信息,分析范圍幾乎囊括了所有有機化合物和混合物,可以對果汁中的可溶性固形物、原果汁含量進行定性定量檢測,在果汁的鑒別和產地溯源中應用前景廣闊。
在漿果果汁的檢測中,多元分析方法和模型建立是紅外光譜可靠性和快速性的有力保障。根據建立不同的分析模型,可以在MIRS和NIR區域對藍莓中的總酚和花青素含量進行評價,而抗壞血酸在MIRS和NIR區域就沒有明顯的參數結果,紅外光譜這種快速無損的檢測形式極大地降低了藍莓質量評價的分析時間和檢測花費[41]。張海紅等[42]采用可見-近紅外光譜技術(visible-near infrared spectrum,VIS-NIR)對3 種不同品牌的沙棘果汁進行研究,結合多元散射校正法(multiplicative scatter correction,MSC)、平均平滑法、PCA以及BP神經網絡對多個樣品進行聚類分析和模型建立,對沙棘不同品牌的果汁鑒定率高達100%。Contal等[43]在純的草莓汁和樹莓汁中分別添加質量分數10%、20%、30%、50%和75%的蘋果汁,采用VIS-NIR技術,最終確定草莓汁和樹莓汁中摻雜蘋果汁的檢測水平分別為>20%和>10%,這種模擬添加的成功為NIR在漿果果汁中添加大宗水果的檢測提供可靠的技術支撐。He Jian等[44]采用全反射傅里葉紅外光譜(attenua total internal reflectance Fourier transform infrared spectroscopy,ATR-FTIR)對不同公司的市售漿果果汁(包括純蔓越莓汁、純葡萄汁、純藍莓汁以及蔓越莓混合汁和藍莓混合汁)進行了區分研究,結合SIMCA的層序聚類分析(hierarchical cluster analysis,HCA)和PCA對不同果汁中的糖成分和酚類物質建立模型。在以含糖豐富度建立的系統樹中,36 種果汁樣品可分為藍莓、葡萄和藍莓3 個集群,與其他集群相比,蔓越莓集群擁有較低的相似性,可能是蔓越莓中含有較高的高奎尼和其他酸類成分。不同于酚類物質,糖成分在果汁中的區別較小,依靠糖成分構建的系統樹對果汁制造商的區分效果不明顯。在酚類系統樹中,藍莓混合汁的集群靠近純藍莓汁,蔓越莓混合汁集群靠近純蔓越莓,表明了多元分析模型在預測果汁成分中的潛力。
2.2.3.2 核磁共振
核磁共振(nuclear magnetic resonance spectroscopy,NMR)是一種基于原子核磁性的光譜技術,通過確定核磁共振中原子核的松弛特性來檢測分子運動,如1H、2H、3H、13C、17O、23Na和31P。目前研究最廣泛的主要是1H-NMR和13C-NMR。豐富的分子結構信息使NMR技術在食品代謝組學中應用廣泛,但在漿果類果汁中的研究還處于起始階段,主要是對漿果進行成分分析和質量控制。
1H-NMR可提供H原子所處的化學環境、相對數目以及分子構型,在水果提取物中擁有數以百計的諧振現象,使得其在水果的原代謝物和次生種屬特異性代謝物分析中應用廣泛。Sobolev等[45]在對多種水果的1H-NMR中發現,代謝物組成的不同造成不同果汁的氫核磁共振圖譜差異明顯。在研究中發現,葡萄糖、果糖和蔗糖存在于所有的果汁中,而棉子糖只出現在獼猴桃中;氨基酸、丙氨酸和纈氨酸幾乎無處不在,但只有黑莓和葡萄中含有甘氨酸和蛋氨酸,賴氨酸僅在獼猴桃和芒果中檢出,利用這種代謝物組成的差異成功鑒定出藍莓、獼猴桃、樹莓等漿果品種。同樣,將NMR應用于藍莓的水溶性(糖、氨基酸、有機酸和酚類化合物)和脂溶性(甘油三酯、甾醇和脂肪酸)代謝物的分析時,藍莓固相萃取物可以用NMR鑒定出5 種水溶性花青素(氯化錦葵色素-3-葡糖苷、錦葵色素-3-半乳糖苷、飛燕草素-3-葡萄糖苷、飛燕草素-3-半乳糖苷以及矮牽牛素-3-葡萄糖苷)以及槲皮素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷成分[46]。在蘋果、葡萄和橘子3 種果汁的糖區域、芳香族區域以及脂肪族區域的1H-NMR光譜的統計處理中,基于芳香族區域的光譜可以有效地將3 種果汁成功區分[47-48]。可見,化學計量學分析同NMR技術相結合可以有效對漿果果汁進行成分識別和果汁區分。
2.3 基于DNA的分子生物學鑒定
理化方法在漿果果汁品質評價中具有很大優勢,但在果汁物種鑒定方面容易受到原材料的產地、品種、加工方式等諸多因素的影響,尤其是當果汁是多品種混合汁時,理化方法的準確性、靈敏度和檢測范圍將會受到很大限制。而DNA是生物遺傳信息的載體,遺傳信息決定生物體的本質,基于DNA的分子生物學技術對物種鑒定的權威性和科學性不容置疑,是近10 a來發展最快的真偽鑒別技術,并已逐漸應用于漿果的物種鑒定中。
基于DNA的分子生物學法通過設計通用引物或者特異性引物和探針,檢測漿果果汁中的漿果成分或其他摻雜的水果成分,著重于對單一果汁、完全勾兌型果汁和混合果汁的真偽鑒別,對由濃縮汁稀釋的果汁鑒定效果不明顯。目前應用于漿果果汁的DNA技術主要包括普通PCR、實時定量基因擴增熒光檢測(real-time quantitative PCR,qPCR)、高分辨率溶解曲線(high-resolution melting,HRM)以及DNA條形碼等。
2.3.1 常規DNA分子技術
在常見的DNA分子生物學技術中,以普通PCR發展最早、應用最廣,是一種在引物、聚合酶、脫氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleotide triphosphate,dNTP)等物質的介導下,經由高溫變性、低溫退火、適溫延伸多個連續過程,將微量DNA進行大量復制的體外擴增技術,擴增產物需進行電泳觀察。qPCR是在PCR擴增過程中,通過在反應體系中加入熒光基團,利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程,解決了普通PCR只能進行終點檢測的局限,是一種靈敏度高、特異性強、快速、簡便的半定量技術,目前以TaqMan探針和SYBR Green I 探針應用最為廣泛。不同于qPCR的特異性熒光探針,HRM利用一種飽和熒光染料,通過不同形狀的熔解曲線分析單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism,SNP)或掃描突變對樣品進行基因分型或歸類,其對樣品的定量精度高于qPCR,廣泛用于食品分析。利用常規的DNA分子技術在食品、環境、制藥等方面的研究已逐漸趨于成熟,其在漿果物種鑒別中的應用已廣泛存在。
Herbst等[49]對葉綠體基因matK采用多重序列比對法設計藍莓和蔓越莓的特異性引物和探針,對來自藍莓和蔓越莓的果實和果汁DNA進行普通PCR擴增,電泳結果顯示該matK區域的引物不能擴增出葡萄、蘋果、梨成分,但藍莓和蔓越莓條帶明亮,顯示了該matK區域引物對越橘屬的特異性,但是該引物不能擴增出蔓越莓果汁和蔓越莓干中的DNA。當針對水果的psbA-trnH區域設計引物,采用聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)分析時,藍莓(465 bp)、接木骨(560 bp)、石榴(463 bp)、蘋果(392 bp)以及梨(411 bp)的葉片和果實DNA可以有效地將幾種物種區分開來。但當應用于市售產品檢測時,果泥和果醬檢測結果較好,果汁中則發現多個擴增產物且片段均小于果實和葉子DNA的擴增片段,數據出現明顯差別,無法對果汁中的DNA進行成分鑒定[50]。這可能是由于加工造成了DNA的降解,熱處理和酸性環境增加了果汁DNA非特異性擴增的可能性,需要進一步設計更短的目標序列以適用于漿果加工制品的檢測。Palmieri[51]和Sordo[52]等從表達序列標簽5S rRNA和花青素合成酶(anthocyanin synthase,ANS)中尋找漿果的引物,通過常規PCR和qPCR,源自ANS的序列可以對草莓、紅樹莓、黑樹莓、蘋果和橘子進行區分,而蘋果、樹莓、藍莓、草莓以及菠蘿和橘子的序列多態性位點在5S rRNA中也有檢出,實現漿果種屬之間以及漿果同其他植物種屬的定性區分,并成功應用于簡單和復雜食品基質中漿果或其他水果成分的識別。
2.3.2 新興DNA條形碼技術
在各種分子檢測中,DNA條形碼被認為是一種強大、快速、成本低且廣泛適用于物種鑒定的方法,是食品真偽鑒別的有效工具。2003年,加拿大科學家Hebert等[53]首次依據核酸序列多樣性關系提出DNA條形碼的概念。類似超市利用條形碼掃描成千上萬的零售商品,DNA條形碼是利用一段較短且相對易擴增的基因片段通過測序后數據庫比對獲得物種信息的生物識別系統。其中,由ATCG 4 種堿基構成的DNA分子一級結構排列方式是基因條碼建立的理論依據,假如一段序列含有10 個核苷酸,那么它的組合方式就有410種,足以區分所有物種。并且DNA條形碼不需要進行特異性引物和探針的設計,通用引物的設計以及測序技術的進步實現真正意義上的高通量檢測,廣泛用于植物物種鑒定和真偽檢測[54]。不同于常規分子檢測在漿果中的廣泛應用,DNA條形碼技術起步較晚,在漿果中的應用報道相對較少,還處于初始研究階段。
Bruni等[55]突破傳統的理化鑒定方法,采用DNA條形碼技術對蘋果屬、接木骨屬以及番茄屬等紅色漿果植物進行了物種鑒定。通過對5 個DNA條形碼候選片段(3 個葉綠體基因(光系統II蛋白D1和組氨酸tRNA連接酶基因間隔區(intergenic spacer region between photosystem II protein D1 and histidine-tRNA ligase,trnH-psbA)、RNA聚合酶β亞基(RNA polymerase β subunit,rpoB)、成熟酶K蛋白基因(maturase K,matK))和2 個核基因(At103基因和sqd1基因))的篩選,發現matK和psbA-trnH在美國國立生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)的序列比對中匹配效果最好,通過兩個片段的結合使用可以大大提高水果的鑒定成功率,建立了以DNA條形碼進行可食用和不可食用水果物種鑒定的方法。Jaakola等[56]采用DNA條形碼結合HRM技術對野生歐洲越橘的8 個品種進行研究,通過對越橘的內轉錄間隔區(internal transcribed spacer,ITS)和質體DNA(trnH-psbA、亮氨酸-tRNA合成酶(tRNA-Leu gene,trnL)、核糖體蛋白L36-核糖體蛋白S8 (ribosomal protein L36-ribosomal protein S8,rpl36-rps8))進行全基因掃描測序,成功鑒別出不同的越橘品種,適用于包含完整DNA片段的加工類漿果制品中越橘成分的鑒定,而在深加工漿果制品中(如果汁),由于DNA斷裂嚴重,其應用受到一定限制。因此,尋找較短的通用目標片段用以區分所有的漿果物種,是目前DNA條形碼在果汁應用中的關鍵點。
目前,漿果果汁的檢測主要是以理化鑒定技術為主,主要應用于果汁產地溯源、營養和功效成分檢測、品質評價等,而通過多元技術結合可對漿果中的主成分甚至是多個成分進行同時分析,能極大提高理化鑒定的靈敏度和準確率。隨著現代分子生物學的發展,基于DNA的分子檢測技術為漿果的質量控制和真偽鑒別提供了新的應用方向。這種基于遺傳信息的檢測方法不受原料產地以及各種環境和加工方式的影響,非常適用于水果品種的鑒定,已經在蘋果、梨等大宗水果果汁的物種鑒定和摻假檢測中得到應用,在漿果果汁的真偽鑒定領域亦有廣闊的發展前景。
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DOI:10.7506/spkx1002-6630-201613044
中圖分類號:TS255.44
文獻標志碼:A
文章編號:1002-6630(2016)13-0243-08
收稿日期:2015-10-10
基金項目:國家質量監督檢驗檢疫總局科技計劃項目(2015IK312)
作者簡介:李梅閣(1990—),女,碩士研究生,研究方向為食品真偽鑒別。E-mail:1310764839@qq.com
*通信作者:陳穎(1972—),女,研究員,博士,研究方向為食品真偽鑒別。E-mail:chenyingcaiq@163.com
Progress in Authentication Technologies for Berry Juice
LI Meige1,2, WU Yajun1, YANG Yange1, XU Xinglian2, CHEN Ying1,*
(1.Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100176, China;2.College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)
Abstract:Berry, mainly represented by blueberry and raspberry, has the reputation of golden fruit.Adulteration,counterfeiting and mislabeling of berry have led to endless disputes on food quality and safety, which poses a great challenge for identification technologies for berry juice authenticity.Nowadays, conventional physicochemical methods and traditional molecular biology methods are commonly used to detect the authenticity of berries, all of which have their advantages and disadvantages.The physicochemical methods are advantageous mainly in quality control and quality evaluation, which,however, are easy to be influenced by individual growth, processing conditions and other external factors involved in the recognition of plant-derived ingredients in products.In addition, the molecular biology methods based on DNA are more commonly used to identify plant-derived ingredients in juice, which complement the physicochemical methods.In this paper,recent progress in the commonly used technologies for quality control and authentication of berry fruits and juices, mainly sensory evaluation, physicochemical technologies and molecular biology technologies, is reviewed.
Key words:berry juice; authenticity; sensory evaluation; physicochemical technology; molecular biology technology