年齡及卵巢刺激對卵子利用率的影響

鄭屹，王海青，周穎（溫州醫科大學附屬第一醫院 生殖醫學中心，浙江 溫州 325015）

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年齡及卵巢刺激對卵子利用率的影響

鄭屹，王海青，周穎
（溫州醫科大學附屬第一醫院 生殖醫學中心，浙江 溫州 325015）

[摘 要]目的：探討不同年齡及卵巢刺激對周期活產率、每卵活產率和每活產所需的卵子數的影響。方法：回顧性分析2012年1月-2014年2月在我院生殖醫學中心行卵胞漿內單精子注射（ICSI）的1 637個有移植周期的臨床資料，按不同年齡或獲成熟卵子個數不同分組，比較各組患者周期活產率、每卵活產率和每活產所需的卵子數，分析臨床結局。結果：每個活產所需成熟卵子數以及每個成熟卵子的活產率顯示卵子質量在23～37歲間相對穩定，37歲之后每卵活產率開始逐步下降，40歲之后顯著下降，實現活產所需的卵子數目增加明顯。卵巢反應性不同的3組比較發現，獲成熟卵子數目多的組，周期累積活產率高，提示周期累積活產率可能與成熟卵子數量有關；每卵活產率與卵巢反應性呈負相關，成熟卵子數越多，每卵活產率越低（P＜0.01），每活產所需的卵子數越多（P＜0.01），提示過度卵巢刺激可能影響卵子質量。結論：估算實現不同年齡女性活產所需的卵母細胞數量對于妊娠結局的預測以及患者咨詢的解答具有一定的指導意義，并可以為希望通過卵子冷凍進行生育力保存的婦女及本中心開展卵子冷凍項目提供參考數據。

[關鍵詞]每卵活產率；周期活產率；卵胞漿內單精子注射；生育力保存

卵子冷凍可以用于接受手術或放化療治療后卵巢功能損傷的癌癥患者的生育力保存，而且，該技術也是對于遺傳性疾病需要預防性切除輸卵管或卵巢；卵巢早衰；進行輔助生殖技術（assissted reproductive technologies，ART）治療的患者取卵日夫方取精失敗；以及那些渴望延長生育計劃女性的一種有效實際的方法。由于目前冷凍保護劑的開發及運用，卵子冷凍的效果也越來越好[1-4]。因此在經過卵巢刺激后所獲得的每個卵子是否可以有活產是患者和醫師最為關心的。雖然每周期或每移植的活產率通常作為體外受精-胚胎移植（in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET）治療結局的衡量指標，但這兩個指標并不能很好地反映卵子和胚胎的生物學效力[5]。有研究表明，盡管經過促性腺激素（Gn）刺激一次手術取卵能獲得多個卵子，但是大部分的卵子（＞95%）和移植胚胎（約85%）沒有活產[6-7]。所以有兩個更重要的概念：每個獲得的成熟卵子的活產率（以下簡稱每卵活產率）和每活產所需的卵子數（即卵巢刺激后卵子的利用能效）[8-10]可能是一個ART結局的更相關指標，對卵子及胚胎的發育潛能更真實準確地評估。每個卵子的積累妊娠率可以為特殊的治療對象提供臨床決策[11]，其主要好處的報道是對于冷凍的價值，它可以為卵子及胚胎冷凍保存提供一個更新更準確的評價方法[12]。另外，年齡是影響妊娠率的最重要的因素[13-14]。隨著年齡增加，女性自然妊娠率和輔助生殖臨床妊娠率均下降，流產率增加，活產率降低，子代的染色體異常概率增加[15-16]，對于冷凍的卵子也是如此。因此，估算實現不同年齡女性活產切實所需的卵母細胞數量對于行ART治療的患者是十分必要的。本研究對我院生殖醫學中心以卵胞漿內單精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）治療方案接受IVF-ET治療的不孕不育患者（共1 637個移植周期）進行回顧性分析，探討成熟卵子的活產率與年齡以及不同卵巢刺激的關系，為以成熟卵子為基礎的IVF-ET臨床結局及卵子冷凍提供信息。

1 資料和方法

1.1一般資料 回顧性分析2012年1月-2014年2月來我院生殖醫學中心行ICSI助孕治療的不育癥患者共1 637個周期的臨床資料。入選標準：因男方因素行ICSI助孕治療的周期。排除標準：①沒有經過控制性超排卵的自然周期；②不成熟卵體外培養周期；③由于各種原因（卵巢過度刺激高風險、無胚胎移植、宮腔積液、患者主觀因素等）行全胚冷凍而未移植胚胎的患者；④由于胚胎質量過差而取消移植的周期。這1 637個ICSI周期，總累積活產率為48.9%（801/1 637），總每卵活產率為6.04% （801/13 271），總體每活產所需的卵子數為16.6個（13 271/801）。患者年齡23～42歲，平均年齡（31.9±4.2）歲。由于小于23歲或高于42歲的有移植周期數量少于20例，且能夠納入研究的高于42歲的周期沒有活產，所以將患者的年齡范圍定在23～42歲。

1.2方法

1.2.1控制性超促排卵（controlled ovarian hyperstimulation，COH）方案：根據患者的年齡、基礎竇卵泡數、基礎性激素水平、是否合并子宮內膜異位癥及既往周期等確定，包括常規長方案、短方案、超長方案、拮抗劑方案和微刺激方案等。冷凍胚胎移植采用自然周期或激素替代周期準備子宮內膜，移植當天復蘇胚胎后30 min，選擇解凍較好的胚胎移植。優質胚胎的標準及可冷凍或移植的胚胎標準均根據本中心胚胎實驗室胚胎評分標準執行，胚胎實驗室胚胎評分標準參照Gardner胚胎評分系統[17]。由于統計成熟卵子數對活產率的關系，所以選擇進行ICSI治療的周期。

1.2.2胚胎移植（embryo transfer，ET）及結果判定：35歲以下患者第1個周期移植2個胚胎，大于1個周期的移植3個胚胎；35歲以上患者移植3個胚胎；囊胚移植均為2個。ET后常規口服地屈孕酮（達芙通，上海蘇威制藥有限公司）每次10 mg，1 d 2次行黃體支持，并肌肉注射黃體酮針劑（浙江仙琚制藥股份有限公司）每次60 mg，1 d 1次。2周后根據尿妊娠試驗判斷是否生化妊娠，4周后行B超檢查可見孕囊和胎心搏動者確定為臨床妊娠，10個月后追蹤妊娠結局并記錄嬰兒出生情況。記錄2組患者雙胚妊娠情況。流產：是指妊娠不滿28周，胎兒體質量不足1 000 g的胚胎或胎兒因各種原因脫離母體而排出體外，其中不滿12周為早期流產（含生化妊娠），12～28周為晚期流產。

1.2.3觀察指標：收集患者的基本病例資料，包括年齡、總獲卵數、成熟卵子數、卵子成熟率（=總成熟卵子數/總獲卵數）、累積活產例數、周期累積活產率（=該周期內所獲胚胎行ET或冷凍胚胎移植后獲活產例數/周期數，表示以周期為單位的累積活產率）、每卵活產率（=活產例數/成熟卵子個數）、每活產所需的卵子數（=成熟卵子數/活產數，表示實現一個活產所需的成熟卵子個數）、嬰兒出生情況、雙胎及多胎活產率。

1.3統計學處理方法 采用SPSS16.0軟件進行數據

2 結果

2.1年齡相關的周期累積活產率、每卵活產率和每活產所需的卵子數比較 根據不同年齡統計各個年齡段的周期累積活產率、每卵活產率和每活產所需的卵子數發現，周期累積活產率隨著年齡的增大而下降，40歲后急劇下降至＜10%；每卵活產率在34歲前隨著年齡的增大而略有下降，35歲后活產率明顯下降，38歲后急劇下降，從37歲的6.2%下降至38歲的4.4%，而42歲及以上＜1%；每活產所需的卵子數也有類似的變化規律，隨著年齡的增大而每活產所需的卵子數目增加，40歲后急劇增加，由40歲前的＜30個增加至40歲后需＞80個。隨著年齡的增加流產率增高（P＜0.01）；37歲后顯著增高，雙胎率總體差異無統計學意義（P＞0.05）；40歲后無雙胎活產。所有周期均無三胎及以上出生。見表1、圖1-2。

表1　不同年齡段周期累積活產率、每卵活產率和每活產所需的卵子數

圖1　女性年齡分組的周期活產率

圖2　女性年齡分組的每卵活產率

圖3　女性年齡分組的每活產所需的卵子數

2.2不同卵巢反應的周期累積活產率、每卵活產率和每活產所需的卵子數比較 獲成熟卵子數目不同的3組比較發現，成熟卵子數目越多的組，周期累積活產率越高，提示周期累積活產率可能與成熟卵子數量有關；每卵活產率與卵巢反應性呈負相關，成熟卵子數11個以上組每卵活產率最低（P＜0.01），每活產所需的卵子數最多（P＜0.01），提示過度卵巢刺激可能影響卵子質量。而且該組平均年齡最小（P＜0.01），雙胎率最高（P＜0.01）。流產率3組間比較差異無統計學意義，但成熟卵子數11個以上組與獲成熟卵子數目1～5個組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2、圖4。

表2　不同成熟卵子數目各組的周期累積活產率、每卵活產率和每活產所需的卵子數

3 討論

年齡是影響女性生育能力的重要因素，女性生育力從35歲開始明顯減退，37歲后減退更迅速[13]。隨著年齡增加，女性自然妊娠率和輔助生殖臨床妊娠率均下降，流產率增加，活產率降低，生育子代的染色體異常概率增加[15-16]。近20年來，ART技術得到了廣泛的發展和認可，尤其是IVF-ET助孕技術日臻成熟，妊娠率獲得了很大提高。然而，年齡仍然是影響妊娠及IVF/ICSI結局的主要因素。在對ART的研究中，高齡對妊娠結局影響的研究很多。大多數學者認為女性年齡≥38歲，尤其是＞40歲時，IVF結局很差[18]，這與我們研究統計發現的不同年齡段的周期累積活產率隨著年齡的增加而降低的結果相符。另外，我們的研究從23歲至42歲每個年齡段進行分析，數據顯示每卵活產率在34歲之前隨著年齡的增大而略有下降，35歲之后明顯下降，38歲之后急劇下降，42歲以上低于1%；每活產所需的卵子數也有類似的變化規律，隨著年齡的增大而增加，40歲之后急劇增加。說明卵子質量在23～37歲之間相對穩定，在38歲之后Gn刺激獲得的卵子質量明顯下降。這一發現與Faddy和Gosden于1995年發現的數學模型[19]在臨床上是相符的，且卵巢組織切片也發現38歲之后小卵泡和閉鎖卵泡顯著增加。小于30歲女性的周期累積活產率總體下降，也存在波動，但每卵活產率的結果穩定，這可能與該年齡段的高獲卵數和低新鮮胚胎移植有關。

第二個有趣的發現是獲卵數對卵子生育潛能的影響以及Gn刺激對卵子利用率的影響。控制性卵巢刺激（controlled ovarian stimulation，COS）技術的優點是可以使多個卵泡發育，獲取多個卵母細胞，以補償IVF-ET操作中由于各個環節導致卵子丟失，以及胚胎種植失敗。獲得的多個胚胎通過冷凍保存，可以進行多次胚胎移植，以提高妊娠機會，最終提高臨床妊娠率。因此，COS已經成為ART中不可或缺的組成部分，但COS過程中使用超生理劑量的Gn導致超生理水平的雌激素可能會影響卵母細胞的質量，破壞卵子的發育調控和同步性，導致核質成熟的不同步，降低卵子的成熟率。高劑量的Gn注射可能會干擾卵母細胞的正常減數分裂、代謝及ATP產生，改變卵母細胞表觀遺傳學修飾，降低其發育潛能等，影響ART臨床治療結局，增加胎兒的安全風險[20]。

圖4　不同卵巢反應性的周期累積活產率、每卵活產率比較

Meniru和Craft在1997年第一次發現每周期的妊娠率隨著獲卵數增加而升高，但是合適移植或冷凍的胚胎比例下降，他們認為可能是因為獲卵數量過多造成的胚胎質量下降[21]。有學者運用核內熒光原位雜交證明了異倍體的形成與卵巢刺激和胚胎培養條件有關[22]。這與我們的發現是相符的，成熟卵子數目越多，周期累積活產率越高，但每卵活產率與卵巢反應性呈負相關，成熟卵子數越多，每卵活產率越低，每活產所需的卵子數越多，提示過度卵巢刺激可能影響卵子質量。

有研究表明，普通女性通過性交懷孕的概率為20%～30%，24歲年齡組的女性臨床妊娠率約為30%[23]。在我們的研究中，經過卵巢刺激的相同年齡組的每個卵子活產率僅為6.04%，而以往研究顯示，自然周期IVF每個卵子持續妊娠率為22.0%～23.2%。因此，我們認為卵巢刺激可能對卵子質量有決定性影響或卵巢刺激從卵巢中募集了可能會產生異常胚胎的閉鎖卵泡。雖然獲卵數低的女性有較高的每卵活產率，但1～5個獲卵數組的女性平均年齡較高，我們認為卵巢低反應組也許是年齡較高，卵巢儲備功能較差，而不是因為Gn用量少造成的獲卵數目少，所以獲卵數目少的低反應組反應了較差的卵巢保存力而可能不能說明溫和的刺激方案會得到較高的每卵活產率。另一方面，卵巢高反應組中冷凍比例影響了新鮮胚胎移植，造成了每卵活產率較低。

雖然COS的發展使IVF周期活產率有所提高，但每卵活產率自1980年至今沒有明顯提高[8]，因此無論一次手術獲卵多少，一次移植最多只能選擇3枚胚胎，即使有一定數量的冷凍胚胎備選，患者也會經歷心理和生理的失落與傷害，問題仍然存在于找到并識別“正確的卵母細胞”，得到發育潛能最高的胚胎，才能提高活產率。我們的研究僅通過對每個年齡段以及不同卵巢反應的數據統計，估計實現不同年齡女性一個活產所需的卵子數，但不同年齡女性的卵巢反應性不同，對Gn刺激的不同反應下的每卵活產率會如何，嚴格的胚胎挑選標準是否能發現發育潛能較高的胚胎，冷凍胚胎對每卵活產率的影響如何，這部分內容嘗試在后續實驗中繼續增加樣本量進行探討。

23～37歲之間的女性每卵活產率和每活產所需的卵子數比較穩定，38歲之后每卵活產率顯著下降，40歲之后急劇下降，實現活產所需的卵子數顯著增加。我們的結果對以期通過卵子或胚胎冷凍進行生育力保存的婦女有參考價值。而且，考慮到采卵、冷凍卵子利用與臨床應用之間的時間差，估算達到一個活產所需的成熟卵子數目是值得的，可以為本中心開展卵子冷凍項目提供數據支持，并且對不育癥治療的妊娠結局的預測以及患者咨詢的解答有一定的指導意義。

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（本文編輯：吳彬）

The influence of age and ovarian stimulation on oocyte utilization

ZHENG Yi,WANG Haiqing,ZHOU Ying.Reproductive Medicine Center,the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou,325015

Abstract:Objective:To explore the effect of live birth per cycle,number of live births per mature oocyte and the number of mature oocytes per live birth according to ovarian ageing and ovarian response.Methods:A total of 1637 ICSI-ET cycles from January 2012 to February 2014 in Reproductive Medicine Center of the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College were retrospectively analyzed.Live birth per cycle,number of live births per mature oocyte and number of mature oocytes per live birth were further analysed in relation to the age or ovarian response.The clinical outcomes were compared.Results:The data presented in this study showed that the number of live births per mature oocyte and the number of oocytes per live birth remained remarkably stable between the age of 23 and 37 years.After the age of 37 years number of live births per mature oocyte began to decrease gradually but from 40 years of age it dropped dramatically,and the number of mature oocytes per live birth increased.On the other hand,the pregnancy rate per cycle increased with the number of retrieved oocytes,so the pregnancy rate per cycle was highly dependent on ovarian response.Compared between the three ovarian response group,number of live births per mature oocyte was lower (P<0.01) and the the number of oocytes per live birth was higher (P<0.01) in the response group with more mature oocytes,which indicated that the ovarian stimulation might affect the reproductive potential of the individual oocyte.Conclusion:These data are extremely valuable as they provide information on the expected outcome in women undergoing fertility preservation.Moreover,it is crucial in the prediction of IVF success and patient counseling and considering the launching oocyte freezing for fertility preservation in our center.

Key words:live birth per mature oocyte; live birth rate per cycle; intracytoplasmic sperm injection; fertility preservation

通信作者：周穎，教授，Email：zy-yin@163.com。

作者簡介：鄭屹（1986-），女，浙江溫州人，碩士。

收稿日期：2015-04-24

[中圖分類號]R321.1

[文獻標志碼]A

DOI:10.3969/j.issn.2095-9400.2016.02.008