PSMA6基因rs1048990位點多態(tài)性與動脈粥樣硬化性腦梗死的相關(guān)性分析

趙西耀，何芳梅（.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院建德分院 神經(jīng)內(nèi)科，浙江 杭州 3600；.西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，陜西 西安 7003）

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PSMA6基因rs1048990位點多態(tài)性與動脈粥樣硬化性腦梗死的相關(guān)性分析

趙西耀1，何芳梅2
（1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院建德分院 神經(jīng)內(nèi)科，浙江 杭州 311600；2.西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，陜西 西安 710032）

[摘 要]目的：研究陜西漢族人群中蛋白酶體α6亞單位（PSMA6）基因rs1048990（-8C/G）位點的多態(tài)性與動脈粥樣硬化性腦梗死的關(guān)系。方法：采用病例對照研究，選擇2012年1月至2013年12月在西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院的162例動脈粥樣硬化性腦梗死患者（病例組）和同期159例健康體檢者（對照組）。應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）檢測PSMA6基因rs1048990位點單核苷酸多態(tài)性，并分析其基因型及等位基因頻率在腦梗死患者及正常人群中的分布特點。結(jié)果：與對照組比，病例組GG基因型頻率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.054），G等位基因頻率差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.05）。分別依據(jù)有無高血壓和糖尿病病史進行分層分析，病例組各基因型及等位基因頻率間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），對照組亦如此。logistics回歸分析發(fā)現(xiàn)，PSMA6基因rs1048990位點GG基因型在病例組和對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.059）。結(jié)論：PSMA6基因rs1048990位點可能與動脈粥樣硬化性腦梗死發(fā)病不相關(guān)，但P值接近有統(tǒng)計學(xué)意義，值得進一步研究。

[關(guān)鍵詞]蛋白酶體α6亞單位；單核苷酸多態(tài)性；動脈粥樣硬化性腦梗死

腦梗死的一個重要原因是動脈粥樣硬化，而后者是由一系列細(xì)胞和分子構(gòu)成的炎癥反應(yīng)所致。目前許多研究提示炎癥系統(tǒng)的基因多態(tài)性，蛋白酶體α6亞單位（proteasome subunit α type 6，PSMA6）rs1048990位點的突變，與高血壓、糖尿病、冠心病及腦卒中相關(guān)[1-7]。本研究在陜西漢族人群中探討PSMA6基因rs1048990位點的頻率分布特點，并分析其基因多態(tài)性與動脈粥樣硬化性腦梗死的相關(guān)性。

1 資料和方法

1.1一般資料 病例組為自2012年1月至2013年12月在西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院的動脈粥樣硬化性腦梗死患者162例，病程在1周內(nèi)，均為陜西漢族人。所有患者均經(jīng)過臨床及CT和/或MRI確診（依照第四屆全國腦血管病學(xué)術(shù)會議診斷標(biāo)準(zhǔn)），排除心臟源性腦栓塞（房顫、心瓣膜病、心肌梗死、二尖瓣脫垂、心臟黏液瘤）、腔隙性腦梗死動脈炎、外傷、血液病、藥物、腫瘤、腦血管畸形或動脈瘤等其他原因引起的腦梗死。對照組為同期該院健康體檢者159例，均為陜西漢族人，均無腦卒中史，并經(jīng)過臨床檢查和/或影像學(xué)檢查排除腦卒中。收集所有研究對象的性別、年齡、煙酒史、既往病史等一般資料。糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)為1999年世界衛(wèi)生組織（WHO）規(guī)定的診斷標(biāo)準(zhǔn)，即空腹血糖（FPG）≥7.0 mmol/L，和/或葡萄糖耐量試驗（OGTT）2 h血糖≥11.1 mmol/L。高血壓診斷標(biāo)準(zhǔn)按照2004年《中國高血壓防治指南》公布的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]。吸煙者指一生中連續(xù)或累計吸煙6個月及以上者。所有標(biāo)本的收集均經(jīng)患者本人或其家屬同意，并簽署知情同意書，并經(jīng)西安醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)研究倫理委員會同意。

1.2方法

1.2.1血樣本的收集及全血DNA的提?。簩⑺腥脒x者在清晨空腹條件下抽取靜脈血5 mL，枸櫞酸鈉（3.8%）抗凝，用碘化鉀法提取外周血白細(xì)胞的基因組DNA，在-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。抽取肘靜脈血3 mL，分離血清，采用ROCHE P800X2全自動生化分析儀測定血糖、血脂。

1.2.2聚合酶鏈反應(yīng)引物及限制性內(nèi)切酶的設(shè)計：引物設(shè)計及內(nèi)切酶的選擇參考賈立昕等[6]的研究，上游引物：5’-GAAGCAGTCGCTGCAACT-3’，下游引物：5’-ACCTGGTTCACTCACCTCATTG-3’，限制性核酸內(nèi)切酶為RsaI。引物由上海生工合成。

1.2.3PSMA6基因rs1048990位點的基因型分型：PCR反應(yīng)體系10.0 μL，其中包括基因組模板DNA 2.0 μL，2×PCR SuperMix 5.0 μL（由EasyTaq DNA聚合酶、dNTP和優(yōu)化的反應(yīng)緩沖液組成，由北京全式金生物技術(shù)有限公司提供），上游及下游引物（50 pmol/L）各0.08 μL，雙蒸水2.84 μL。反應(yīng)條件：94 ℃熱變性5 min；94 ℃ 35 s，退火58 ℃ 34 s，延伸72 ℃ 30 s，擴增36個循環(huán)后延伸72 ℃ 10 min，終止反應(yīng)。

PCR產(chǎn)物的限制性內(nèi)切酶消化：酶切反應(yīng)體系10 μL：PCR產(chǎn)物5 μL，10×NEBuffer 4 1.0 μL，10 000 U/mL限制性核酸內(nèi)切酶RsaI 0.1 μL（由美國New England Biolabs公司提供），雙蒸水3.9 μL，37 ℃水浴12 h。

8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳：在酶切體系產(chǎn)物中加入2 μL 6×Loading Buffer，混合后全部上樣，以1×TBE緩沖液為電泳液，在電壓100 V下電泳約120 min，取下凝膠進行銀染，觀察結(jié)果并拍照，用透明薄膜封閉好，4 ℃保存。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析。計數(shù)資料采用t檢驗，以±s表示?；蛐皖l率和等位基因頻率采用基因計數(shù)法計算、Hardy-Weinburg平衡吻合度檢測，等位基因和基因型頻率比較采用x2檢驗，各變量與腦梗死的關(guān)系采用logistic回歸分析進行檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.12組的一般資料比較 2組性別構(gòu)成、年齡、膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白及低密度脂蛋白差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），高血壓、糖尿病、血糖及吸煙在2組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.2PSMA6基因rs1048990位點檢測結(jié)果 rs1048990位點的擴增片段長度為185 bp，RsaI酶為此PCR片段的單位點內(nèi)切酶，C/C基因型的擴增片段不存在酶切位點，將出現(xiàn)185 bp一條帶；G/G基因型存在酶切位點，將出現(xiàn)98 bp和87 bp兩條帶；C/G基因型則產(chǎn)生185 bp、98 bp和87 bp三條帶。PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切后的電泳結(jié)果見圖1。

2.32組研究對象Hardy-Weinburg平衡檢驗 PSMA6基因rs1048990位點病例組基因型分布經(jīng)x2檢驗符合Hardy-Weinburg平衡（x2=0.132245，P=0.716116）；對照組亦符合Hardy-Weinburg平衡（x2=1.847593，P=0.174064），表明該多態(tài)性位點的基因型分布在所研究人群中已達(dá)到了遺傳平衡，樣本具有群體代表性。

2.4PSMA6基因rs1048990位點的基因型及等位基因頻率 病例組中G/G基因型頻率為11.7%（19/ 162），對照組為5.7%（9/159），見表2。GG基因型頻率2組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.054），OR值為0.452（95%CI：0.198～1.031）；CC基因型頻率2組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.134）；G等位基因頻率2組比較差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.05），OR值為0.716（95%CI：0.512～1.000）。在病例組中，依據(jù)有無高血壓病史，對各基因型及等位基因頻率進行比較，見表3。在病例組中，依據(jù)有無糖尿病病史，對各基因型及等位基因頻率進行比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。在對照組中，根據(jù)有無高血壓、糖尿病進行分層，各基因型及等位基因頻率間差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

2.5logistic回歸分析腦梗死患病因素 以腦梗死為因變量，腦梗死的危險因素為自變量進行l(wèi)ogistic回歸分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PSMA6基因rs1048990位點GG基因型在2組中比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（OR值：0.452，95%CI：0.198～1.031，P=0.059），見表4。

表1　2組一般資料及卒中危險因素對比（±s）

表1　2組一般資料及卒中危險因素對比（±s）

與對照組比：aP＜0.05

類別　　病例組（n=162）　對照組（n=159）性別（男/女）　107/55　96/63年齡（歲）　67.40±8.70a　 66.50±8.10高血壓[n（%）]　96（59.3）a　41（25.8）糖尿病[n（%）]　43（26.5）a　 9（ 5.7）血糖（mmol/L）　 6.49±2.58a　 5.23±1.89吸煙[n（%）]　51（31.5）a　24（15.1）膽固醇（mmol/L）　 5.20±2.13a　 4.92±0.98甘油三酯（mmol/L）　 1.52±0.93a　 1.32±0.22高密度脂蛋白（mmol/L）　 1.28±0.08a　 1.42±0.42低密度脂蛋白（mmol/L）　 3.88±1.02a　 3.49±0.92

圖1　RsaI酶酶切PSMA6基因rs1048990位點擴增片段后產(chǎn)物電泳圖

表2　2組研究對象PSMA6基因rs1048990位點基因型及等位基因頻率比較[n（%）]

表3　有高血壓與無高血壓病史的病例組患者的基因型及等位基因頻率比較[n（%）]

3 討論

泛素-蛋白酶體系由26S蛋白酶體、泛素等成分組成。真核細(xì)胞內(nèi)的26S蛋白酶體核心是一個20S的催化顆粒，由α環(huán)和β環(huán)組成。人類的PSMA6基因編碼PSMA6，后者參與組成20S催化顆粒的α環(huán)。目的蛋白進入20S亞基核心內(nèi)將被降解成低聚肽[7]，這在蛋白降解、細(xì)胞內(nèi)通路（包括炎癥通路）的調(diào)節(jié)中起重要作用[4-9]。

參與動脈粥樣硬化形成的炎癥因素在腦梗死的發(fā)病中起了重要作用。Freilinger等[10]對德國人群進行了研究，他們基于國際人類基因組單體型圖計劃數(shù)據(jù)，運用標(biāo)簽演繹法進行單核苷酸多態(tài)性的選擇，首先對卒中患者進行TOAST分型后，運用MALDI-TOF質(zhì)譜法進行基因分型，發(fā)現(xiàn)PSMA6基因rs1048990位點的多態(tài)性降低德國人總體缺血性卒中（OR：0.80，P=0.037）和大動脈粥樣硬化性卒中（OR：0.70，P=0.042）的風(fēng)險。Savchuk等[11]對102例烏克蘭缺血性卒中患者和92例對照者，運用實時PCR方法，進行PSMA6（rs1048990位點）的基因型分型，發(fā)現(xiàn)PSMA6-8G/G突變體與復(fù)發(fā)性缺血性卒中相關(guān)。Heckman等[1]對20個先前報道與心肌梗死及冠心病相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性位點在卒中患者中進行相關(guān)性檢驗，研究對象為患有缺血性卒中的713例白種人和166例非裔美國人以及825例對照者。將患者分為家族性白人亞組、缺血性卒中的遺傳學(xué)研究白人亞組和非裔美國人缺血性卒中亞組，運用多元logistic回歸分析模型的比值比進行分析，發(fā)現(xiàn)在家族性白人亞組中，惟一與缺血性卒中相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性是PSMA6基因rs1048990位點（OR= 0.72，P=0.038），起保護性作用，也就是降低卒中風(fēng)險，并且獨立于傳統(tǒng)危險因素。合并家族性和缺血性卒中的遺傳學(xué)研究白人亞組中，仍然具有顯著相關(guān)意義的位點是rs1048990（OR=0.80，P=0.036）。在例數(shù)較少（166例缺血性卒中和117例對照者）的非裔美國人中，獨立于傳統(tǒng)危險因素的相關(guān)位點仍是rs1048990（OR=0.31，P=0.020）。

但亦有研究得出相反的結(jié)論。Banerjee等[13]在北印度居民中，通過對176例卒中患者（112例缺血性卒中，64例出血性卒中）和212例對照者作為研究對象，運用PCR-RFPL的方法進行研究，在調(diào)整了混雜因素后，未發(fā)現(xiàn)PSMA6基因rs1048990位點多態(tài)性與腦卒中在基因型及等位基因頻率上存在相關(guān)性。羅冬等[14]也發(fā)現(xiàn)PSMA6基因rs1048990位點多態(tài)性可能與中國湖南漢族人群腦卒中發(fā)病無關(guān)，且該多態(tài)性位點可能與各研究組的血壓、空腹血糖及血脂代謝亦無關(guān)聯(lián)。

本研究亦發(fā)現(xiàn)PSMA6基因rs1048990位點與陜西漢族人動脈粥樣硬化性腦梗死無相關(guān)性。本實驗對162例腦梗死患者和159例健康對照者PSMA6基因rs1048990位點進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2組間GG基因型頻率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.054），G等位基因頻率的差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.05）。而依據(jù)有無高血壓、糖尿病病史，分別對病例組、對照組進行分層分析，各基因型間及等位基因頻率間均未發(fā)現(xiàn)差異有統(tǒng)計學(xué)意義。以腦梗死為因變量，腦梗死的危險因素為自變量進行l(wèi)ogistic回歸分析，發(fā)現(xiàn)PSMA6基因rs1048990位點GG基因型在病例組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.059），但P值接近有統(tǒng)計學(xué)意義，值得進一步研究。

目前關(guān)于PSMA6基因與腦梗死相關(guān)性的研究的結(jié)果不一致，分析其原因：①種族的差異，基因型及等位基因頻率分布明顯不同；②環(huán)境因素、研究對象選擇標(biāo)準(zhǔn)等的差異或者基因多態(tài)性間的連鎖不平衡作用所致；③研究的樣本量不夠大，導(dǎo)致統(tǒng)計學(xué)效度不足；④樣本偏倚，如某些研究的病例分布不一定符合Hardy-Weinburg平衡規(guī)律。鑒于目前各研究中該相關(guān)性存在不一致性，需要進一步的研究來確定該基因變異對缺血性卒中及其亞型發(fā)病的作用。

表4　2組研究對象logistic回歸分析結(jié)果

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（本文編輯：趙翠翠，丁敏嬌）

·讀者·作者·編者·

The correlative analysis of PSMA6 rs1048990 single-nucleotide polymorphism and artery atherosclerosis cerebral infarction

ZHAO Xiyao1,HE Fangmei2.1.Department of Neurology,the Second Affiliated Hospital,Jiande Branch,School of Medicine,Zhejiang University,Hangzhou,311600; 2.Department of Neurology,the First Affiliated Hospital of Xi’an Medical College,Xi’an,710032

Abstract:Objective:To investigate the correlation between rs1048990(-8C/G) polymorphism of proteasome subunit alpha type 6(PSMA6) gene and artery atherosclerosis cerebral infarction in Han population of the Shanxi province in China.Methods:By using a case-control method,162 patients with artery atherosclerosis cerebral infarction (the case group) and 159 healthy controls over the same period (the control group) were selected in the study.The patients were in hospital of the department of neurology in the Affiliated Hospital of Xi’an Medical College from January 2012 to December 2013.The single nucleotide polymorphism of rs1048990 of PSMA6 gene was identified by the polymerase chain reaction (PCR) and restriction fragment length polymorphism(RFLP),and genotype and allele frequency distributions in cerebral infarction patients and healthy controls were analyzed.Results:Compared with the control group,the difference of the frequency of GG genetype in the the case group wasn’t significant (P=0.054),the difference of the frequency of G allele wasn’t significant,either (P=0.05).After stratified by suffering from high blood pressure and diabetes,respectively,we didn’t find significant differences among all genotypes and alleles in the case group (all P>0.05); the same result had been found in the control group,too.After adjustment for known cerebral vascular risk factors by logistic regression analysis,the GG genotype of rs1048990 revealed no statistical significance between the case group and the control group (P=0.059).Conclusion:The rs1048990 of PSMA6 gene mayn’t be associated with the artery atherosclerosis cerebral infarction.But the P value approximate statistical significance,the single nucleotide polymorphism is worth further researches.

Key words:proteasome subunit alpha type 6; single nucleotide polymorphism; artery atherosclerosis cerebral infarction

作者簡介：趙西耀（1980-），男，河南開封人，主治醫(yī)師，碩士。

基金項目：陜西省教育廳專項科研計劃項目（2010JK803）。

收稿日期：2015-06-03

[中圖分類號]R743.32

[文獻標(biāo)志碼]A

DOI:10.3969/j.issn.2095-9400.2016.02.005